董金香邓　毅，2*刘　靓赵　妮曼　琼吴国侠杨志军（.甘肃中医药大学　兰州730000；2.甘肃省中药药理与毒理学重点实验室　兰州　730000）

甘肃野生甘草内生菌发酵液与宿主水煎液、总黄酮、总皂苷对LPS致raw264.7分泌炎症因子的影响△

董金香1邓毅1，2*刘靓1赵妮1曼琼1吴国侠1杨志军1（1.甘肃中医药大学兰州730000；2.甘肃省中药药理与毒理学重点实验室兰州730000）

摘要：目的：研究甘肃野生甘草内生菌发酵液与宿主水煎液、总黄酮、总皂苷对LPS刺激的raw264.7细胞炎症模型分泌炎症因子的调节作用。方法：采用Griess法、ELISA法检测甘肃野生甘草内生菌有效菌株发酵液与宿主水煎液、总黄酮提取物、总皂苷提取物对LPS刺激raw264.7细胞分泌NO、TNF-α、IL-6含量。结果：经LPS刺激后，与模型组相比，野生甘草的水煎液和野生甘草的总黄酮、总皂苷以及其有效菌株的发酵液均能抑制NO、TNF-α、IL-6的分泌（P＜0.05）。结论：甘草内生菌JTYB018、JTYF027的发酵液有抑制raw264.7分泌NO、TNF-α、IL-6的作用。

关键词：甘草 raw264.7内生菌 总黄酮 总皂苷 抗炎

甘草，补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药，由于疗效好、作用广，素有“中草药之王”的美誉。植物内生菌（endophyte）是指生活在健康植物组织和器官内部的真菌或细菌，不会使宿主植物致病，是宿主植物在长期进化过程中衍生出的一类微生物，与宿主植物相互影响能产生与其相同或相似的作用成分。又有研究发现，甘草总黄酮［1～3］和甘草总皂苷［4］有不同途径的抗炎作用，考虑其内生菌是否能产生甘草总黄酮、甘草总皂苷或与其相似结构的物质从而取代甘草，为解决植物甘草的大量需求，缓解资源濒临灭绝的危机，本实验从甘草的抗炎作用方面着手探究，比较观察5株有效菌株与宿主水煎液、总黄酮、总皂苷体外抗炎的效果。

1材料

1.1药品：甘肃省酒泉市金塔县野生乌拉尔甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch。

1.2试剂：raw264.7，LPS，DMEM培养基，血清，青霉素-链霉素溶液，PBS，乙醇，氨水，浓盐酸，马铃薯葡萄糖水（马铃薯葡萄糖培养基HB0233）营养琼脂（NA，青岛高科园海博生物技术，营养肉汤）一氧化氮检测试剂盒（TNF-α试剂盒，IL-6试剂盒）。

1.3仪器：超净工作台（天津市泰斯特仪器有限公司，型号：CJ-2S），9082-B型电热恒温培养箱（上海福玛实验设备有限公司），二氧化碳培养箱（SHEL L/JB），医用低速离心机（金坛市恒丰仪器厂，LXJ-802），全温摇床柜（IKA-KS 4000i control），倒置显微镜（Ti-nikon），LDZX-30FB立体压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂），酶标仪。

2方法

2.1内生菌发酵液的制备和有效菌株的筛选：将野生甘草内生菌分离纯化培养［5］，最终从野生甘草中分离出63株内生菌，其中内生细菌31株（JTYB001、JTYB002、JTYB003…JTYB031），内生真菌32株（JTYF001、JTYF002、JTYF003…JTYF032）；在无菌操作台中，从已活化好的NA、PDA平板培养基挑取2环菌饼于

250mL装有100mL的营养肉汤和马铃薯葡萄糖培养基的摇瓶中，分别以28℃、170r/min的摇床上震荡培养4d、7d，得到发酵液。将发酵液经6层纱布过滤，放于蒸发皿中，在水浴锅调至70℃蒸干至浸膏，分别称取10mg，用DMEM培养基定容至5mL，即得2mg/mL的母液，备用。测其对LPS致raw264.7分泌NO、TNF-α、IL-6炎症因子量的影响，从而筛选出有效的菌株。2.2甘草水煎液的制备：野生甘草破碎至1～3mm长度，取10g加100mL水，浸泡30min，武火加热，文火煎煮60min，4层纱布过滤，滤液旋转蒸干至浸膏，称取4g，用DMEM 2mL稀释，得到2mg/mL的母液，于冰箱保存备用。

2.3甘草总黄酮和总皂苷制备：在乙醇浓度80%，料液比1∶10和40℃的条件下，超声提取40min。将提取液浓缩，加氨水直至溶液为碱性，用乙酸乙酯萃取4次，浓缩至固体，即得甘草总黄酮，紫外分光法测得其含量为75%。收集下层萃取液，加盐酸至pH 为1～2，冰箱静置，使甘草总皂苷充分沉淀，离心，取沉淀，干燥至恒重，即得甘草总皂苷，紫外分光法测得其含量为45%［6］。

2.4细胞培养与储存：将raw264.7放于含10%的胎牛血清和1%的青霉素-链霉素的DMEM高糖培养基中，37℃、5%CO2培养箱中进行传代培养，直至实验所需量，再将5～10支细胞株冻存在-80℃超低温冰箱，隔夜后永久保存在液氮中。

2.5采用Griess法检测细胞上清液中NO的含量：用Griess法检测内生细菌发酵液对LPS诱导的NO产物的抑制作用，取指数生长期raw264.7配制成细胞悬液，分别以1×106个/mL接种于96孔板中，培养24h，弃去培养液，每孔加100μL不完全培养基，饥饿4h吸弃。空白组加完全培养基200μL，LPS组加100μL完全培养基和100μL（20μg/mL）LPS，终浓度为10μg/mL；实验组加入100μL LPS（20μg/mL）和JTYB0028、JTYF027的样品母液，终浓度为10μg/mL，每个样品有6个复孔，干预24h。实验分为空白对照组、LPS阳性对照组、LPS加JTYB028组、LPS加JTYF027组，48h后检测细胞上清液中NO的含量，按照Griess试剂盒说明书操作。

2.6双抗体夹心ELISA实验：方法同“2.5”，实验组加入100μL LPS（20μg/mL）和100μL的JTYB018、JTYF027样品母液，终浓度为10μg/mL，具体操作按照试剂盒说明书。

3结果

各有效菌株发酵液与宿主水煎液、总黄酮、总皂苷对raw264.7分泌NO、TNF-α、IL-6的影响，结果见表1。

表1各样品溶液对raw264.7分泌NO、TNF-α、IL-6的影响（±s）（n=6）

表1各样品溶液对raw264.7分泌NO、TNF-α、IL-6的影响（±s）（n=6）

注：JTYB：野生甘草内生细菌，JTYF：野生甘草真菌

组别（10μg/mL）　NO浓度/（μmol/L）　TNF-α浓度/（pg/mL）　IL-6浓度/（pg/mL）空白组3.18±2.21**　193.38±86.30**　10.76±5.69**模型（LPS）组　14.28±2.10　2803.46±343.43　3031.06.±796.50野生甘草水煎液组　8.14±3.247**　1783.12±220.71**1443.23±569.68**野生甘草总黄酮组　5.65±2.44**　1700.52±124.23**1482.89±510.15**野生甘草总皂苷组　5.35±2.32**　1911.18±508.01**1704.85±449.34**JTYB018　7.75±2.79**　1502.21±334.23**☆　1594.47±320.83**JTYF027　6.99±1.83**　1620.84±502.54**1519.76±490.74**

与模型组比较**P＜0.05；与野生甘草总皂苷组比较☆P＜0.05。

结果表明，在LPS刺激下，模型组细胞释放的NO、TNF-α、IL-6浓度高于空白组（P＜0.05），造模成功。与模型组相比，野生甘草水煎液、野生甘草总黄酮、野生甘草总皂苷和野生甘草各有效菌株对炎症模型Raw264.7炎症因子的分泌均有抑制作用（P＜0.05）；与野生甘草水煎液组、野生甘草总黄酮组、野生甘草总皂苷组相比，JTYF027无差异，表明其抑制作用无差异；JTYB018的TNF-α分泌量与野生甘草总皂苷比较；强于野生甘草总皂苷组（P＜0.05）；JTYB018的NO和IL-6分泌与野生甘草水煎液组、野生甘草总黄酮组、野生甘草总皂苷组相比无差异。

4讨论

LPS是革兰氏阴性菌的主要致病成分，成为现代体外实验常用的造模用药。研究发现，当巨噬细胞受到外界抗原刺激时（如内毒素）便会释放一氧化氮（NO）、白介素（IL）、肿瘤坏死因子（TNF）等重要的炎症细胞因子，它们均可促进炎症反应和组织损伤。本实验中，通过观察LPS诱导炎症因子NO、TNF-α、IL-6的分泌量判断体外炎症模型造的成功与否。从实验结果中可以得出野生甘草水煎液、野生甘草总黄酮和野生甘草总皂苷组抑制炎症因子分泌作用与JTYF027对NO、TNF-α、IL-6分泌的作用无差异，而JTYB018的抑制TNF-α作用还高于野生甘草总皂苷组，其他亦无差异。我们假想菌株的代谢产物中可能含有与甘草药效成分相关的物质。本课题后续部分，我们将思考大批量生产发酵液，并从发酵液中进行成分的提取分离方面的研究，考虑是否有与植物甘草提取的成分相关或相似的物质，从而为解决甘草资源逐渐紧缺问题奠定基础。

参考文献

［1］郝飞.甘草酸国外研究的进展［J］.中国药房，2001，12（1）：13-15.

［2］欧阳国栋，吴渊，王陈坤，等.复方甘草酸苷治疗抗结核药物性肝炎的临床疗效［J］.临床研究，2012，2（4）：172-173.

［3］张宏方.中药甘草作为“使药”的规律探讨［J］.陕西中医学院学报，2010，33（5）：5-7.

［4］李晓红，齐云，蔡润兰，等.甘草总皂苷抗炎作用机制研究［J］.中国实验方剂学杂志，2010，16（5）：110-113.

［5］刘霞，党峰峰，贺晓龙，等.陕北野生甘草内生菌的分离及抑菌活性筛选［J］.西北植物学报，2010，30（10）：2110-2115.

［6］吴桐，白长胜，谭佳音，等.乌拉尔甘草内生真菌的分离及其抑菌活性研究［J］.中国食品学报，2014，2（14）：155-160.

中图分类号：R284.1

文献标识码：B

文章编号：1672-8351（2016）07-0137-02

基金项目：△国家自然基金：甘草内生菌有效菌株代谢产物与甘草药效成分的相关性研究，编号81360633。

*通讯作者