HPLC法测定盐酸度洛西汀原料药中的甲醛含量

2016-07-29王均明伍蔚萍浙江燎原药业股份有限公司临海317016

北方药学 2016年7期

吴　琼　王均明　伍蔚萍（浙江燎原药业股份有限公司　临海　317016）

吴琼王均明伍蔚萍（浙江燎原药业股份有限公司临海317016）

摘要：目的：建立测定盐酸度洛西汀原料药中甲醛含量的HPLC方法。方法：利用甲醛可与1，4-二硝基苯肼反应生产甲醛2，4-二硝基苯腙的衍生物的原理，对甲醛衍生物采用HPLC分析，色谱条件：色谱柱为Agilent XDB C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈-水（60∶40，V/V），等度洗脱；流速1.0mL/min；柱温30℃；检测波长为360nm。结果：甲醛衍生物与待测样品中未知峰能分开，甲醛检测限约为0.4ppm。结论：该方法操作简便、灵敏、稳定可靠，可用于盐酸度洛西汀原料药中甲醛含量的检测。

关键词：甲醛含量盐酸度洛西汀 HPLC

盐酸度洛西汀，化学名为（S）-（+）-N，N-二甲基-3-（1-萘氧基）-3-（2-噻吩）-丙胺盐酸盐，主治抑郁症。在盐酸度洛西汀的生产过程中使用了甲醛溶剂，由于甲醛对人体有危害，已被世界卫生组织确定为致癌和致畸形物质，需要严格控制甲醛在原料药中的残留量。根据盐酸度洛西汀的日剂量，企业初步确定对甲醛的限度规定为20ppm。从葛兴等［1］对甲醛的几种测定方法概述中，了解到对甲醛含量的测定方法有分光光度法、色谱法、电化学法以及化学滴定法。在这几种方法中，色谱法以专属性、灵敏度高有较大优势。陈建芬等［2］利用高效液相色谱法对口腔护理产品中的甲醛进行研究，曹国华等［3］采用高效液相色谱法测定了盐酸四环素原料药中甲醛含量，笔者借鉴了上述采用高效液相色谱法测定甲醛残留的文献以及USP35版盐酸噻氯匹定［4］的甲醛含量测定方法，即利用2，4-二硝基苯肼在酸性条件下可与含有甲醛的样品反应，生成甲醛2，4-二硝基苯腙衍生物后，在360nm波长下，对其衍生物用HPLC进行分析，从而获得甲醛含量方法。通过试验证明，该方法专属、稳定、可靠。

1实验材料

Agilent 1200（包括二元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、VWD检测器、Chemistation色谱工作站）；XS205型电子天平（梅特勒-托利多公司）。

甲醛水溶液（含量为37.3%，ACS级别）、盐酸度洛西汀样品（浙江燎原药业有限公司）；2，4-二硝基苯肼（99.6%，国药集团化学试剂有限公司）；甲醛2，4-二硝基苯腙（98%，TCI）；甲醇、乙腈（色谱纯，天津康科德科技有限公司）。

2方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1稀释液：流动相A:流动相B=50∶50（V∶V）。

2.1.2 2N盐酸溶液：取9mL盐酸加水稀释成50mL，即得。

2.1.3 2，4-二硝基苯肼溶液：称取82.5mg的2.4-二硝基苯肼置于50mL量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，混匀，即得。

2.1.4标准储备溶液：称取甲醛水溶液（37.3%）500mg置于100mL量瓶中，精密称定，用甲醇稀释至刻度，混匀。

2.1.5标准溶液：移取1.0mL标准储备溶液置于100mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀；再移取1.0mL上述稀释过的溶液置于10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀，获得甲醛浓度为1.85μg/mL。

2.1.6样品溶液：取盐酸度洛西汀供试品约0.50g，精密称定，置于10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，混匀。（若有必要可超声使样品完全溶解！）

2.1.7衍生空白溶液：移取2.0mL的2，4-二硝基苯肼溶液至10mL量瓶中，再取50μL的2N盐酸溶液至此量瓶中，再移取270μL甲醇至此量瓶中，摇匀，室温下放置反应40min［4］，再加稀释液至刻度，混匀，即得。

2.1.8衍生标准溶液：移取2.0mL的2，4-二硝基苯肼溶液至10mL量瓶中，再取50μL的2N盐酸溶液至此量瓶中，再移取270μL标准溶液至此量瓶中，摇匀，室温下放置反应40min，再加稀释液至刻度，混匀，即得。

2.1.9衍生样品溶液：移取2.0mL的2，4-二硝基苯肼溶液至10mL量瓶中，再取50μL的2N盐酸至此量瓶中，再移取270μL供试品溶液至此量瓶中，摇匀，室温下放置40min，再加稀释液至刻度，混匀，即得。

2.1.10甲醛2，4-二硝基苯腙溶液：称取约50mg的甲醛2，4-二硝基苯腙，置于100mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，混匀；再移取此溶液1.0mL至100mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀，获得浓度约为5μg/mL的溶液。

2.1.11加样混合溶液：移取2.0mL的2，4-二硝基苯肼溶液置一10mL量瓶中，再取50μL的2N盐酸溶液至此量瓶中，再移取270μL供试品溶液和270μL标准溶液至此量瓶中，摇匀，室温下放置反应40min，再加稀释液至刻度，混匀，即得。

注：各衍生溶液应在配制好的4h内进样分析［4］。

2.2色谱条件：Agilent XDB C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈-水（60∶40，V/V），检测波长：360nm；流速：1.0mL· min-1；柱温：30℃；进样量：10μL；运行时间：38min。

2.3方法学考察

2.3.1专属性：确认空白溶剂其他杂质对目标峰的测定干扰。取衍生空白溶液、衍生标准溶液、甲醛2，4-二硝基苯腙溶液、加样混合溶液进样测定，图谱分别见图1～图4。

从图1看出，空白溶液在目标峰甲醛-2.4二硝基苯腙的位置有干扰，估计由试剂2，4-二硝基苯肼试剂本身带入而无法消除，因此在计算甲醛含量时，需要扣除空白值。

从图2和图3可以看出，衍生标准溶液的甲醛衍生物与甲醛2，4-二硝基苯腙的峰保留时间一致，所以判断RT约10.6min峰是甲醛衍生物即甲醛2，4-二硝基苯腙的色谱峰。从图4加样混合溶液色谱图可看出，样品中其他杂质峰并未干扰目标峰甲醛-2.4二硝基苯腙，目标峰与后面的一小峰（来源于空白溶液峰）的分离度也能达到1.5，表明该方法专属性良好。

2.3.2检测限（LOD）：按照信噪比为3∶1的要求配制目标峰的检测限溶液（具体配制过程：移取2.0mL的2，4-二硝基苯肼溶液至10mL量瓶中，再取50μL的2N盐酸溶液至此容量瓶中，再移取3μL标准溶液至此量瓶中，摇匀，室温下放置反应40min，再加稀释液至刻度，混匀，即得）。检测限溶液须连续进样3针，从Agilent Chemstation工作站图谱数据获得3次进样的信噪比（S/N）分别为3.4，3.5，2.9，其平均值为约3.3，对应的甲醛LOD值约为0.4ppm，对于甲醛要求的限度20ppm来说，此检测灵敏度满足要求。

2.4样品测定：取3批盐酸度洛西汀样品，按“衍生样品溶液”方法操作制备溶液，每批样品平行制备2份，每份测定1次，记录色谱图，具体结果见表1。

甲醛含量计算方式：要求各衍生样品溶液中甲醛2，4-二硝基苯腙的峰面积（AU）不得超过衍生标准溶液中此峰面积的一半（AS/2），即对应甲醛的限度不得大于20ppm。

具体结果见表1。