王丽霞（英科新创（厦门）科技有限公司生化技术部　厦门　361022）

免疫比浊法测定胱抑素C抗原过量研究

王丽霞（英科新创（厦门）科技有限公司生化技术部厦门361022）

摘要：目的：通过对免疫比浊法测定胱抑素C抗原抗体剂量反应曲线的研究分析，筛选试剂研制过程中最合适的抗体用量，研制出优质的试剂，同时准确掌握试剂盒抗原过量的情况，指导临床应用过程中及时对抗原过量的标本进行稀释，从而确保高浓度临床标本测定的准确性。方法：通过配制一系列浓度由高到低的抗原溶液，与采用不同抗体用量但各项性能仍符合注册标准的试剂进行反应，记录反应吸光度，绘制抗原抗体剂量反应曲线，通过对比不同抗体用量配制的试剂的抗原抗体剂量反应曲线达到峰值时的抗原浓度值及吸光度值，结合仪器吸光度测定量程，确定试剂盒研制过程中抗体的最佳用量。

关键词：胱抑素C免疫比浊法 抗原抗体

血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C在临床上通常被称为胱抑素C（Cystatin C，Cys C），是一种低分子量、碱性非糖蛋白质，由120个氨基酸组成，分子量为130KDa。胱抑素C经肾小球自由滤过，在近曲小管被重吸收并降解，肾脏是清除循环中胱抑素C的唯一器官，所以血清胱抑素C的浓度主要有肾小球滤过率（GFR）决定，是一种反映GFR变化的理想内源性标志物［1～3］。

Cys C测定方法很多，目前，中国临床实验室测定血清胱抑素C的方法主要有两类，一类是在特种蛋白分析仪上用散射比浊法进行测定，另一种是在全自动生化分析仪上用透射比浊法进行测定。免疫比浊法分析的基本原理是当抗原与抗体在稀释系统中反应而比例合适时，形成的免疫复合物在沉淀促进剂的作用下，于液相中形成微粒，并产生浊度。当抗体过量且固定时，溶液中待测抗原的浓度在一定范围内与免疫复合物的生成量成正比［4］，由此可见，抗原是否过量直接关系到物质测定的准确性。本文对免疫比浊法测定胱抑素C试剂盒在抗原过量方面进行研究，利用剂量反应曲线的变化特征，得出试剂抗原过量的情况，从而对试剂盒研制过程中抗体的用量进行指导，开发出优质的试剂盒，减少临床应用过程中因抗原过量而造成的测定结果不准确情况，报道如下。

1材料与方法

1.1抗原、抗体：抗原购自北京百川飞虹生物科技有限公司，抗体购自DAKO公司。

1.2试剂及配套校准品：胱抑素C（Cys-C）测定试剂盒（免疫比浊法）及其配套使用的校准品，由英科新创（厦门）科技有限公司研制，校准品由五个浓度水平，分别为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mg/L。

1.3仪器：AU400全自动生化分析仪，日本奥林巴斯公司生产，吸光度测定量程：-2.5～2.5Abs。

1.4方法：免疫透射比浊法，自编测定程序，主要反应参数为样本6μL，试剂1∶180μL，试剂2∶45μL，测定波长540nm，校准类型：多点校准（spline函数拟合），反应温度：37℃，反应时间：10min，分析模式：两点终点法，测光点：12～27。

2结果与讨论

2.1抗原抗体反应的剂量反应曲线分析：采用高浓度的抗原配制一系列Cys C浓度值为0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0、18.0、20.0、24.0、26.0、28.0、30.0mg/L的溶液；因免疫比浊法试剂工艺过程复杂，抗体量加入过多易造成凝集，抗体量过少无法达到试剂灵敏度及线性范围的要求，在试剂研制过程中，在符合试剂注册标准要求且不产生凝集的限度下采用不同抗体用量配制Cys-C试剂，并与上述配制的一系列抗原溶液进行反应，测定反应吸光度；以Cys C浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制剂量反应曲线，结果见图1。

从图1可以看出，免疫比浊法测定Cys C的剂量反应曲线是一条双相反应曲线，在恒定剂量的抗体溶液中加入不同剂量的抗原时，反应吸光度起初随着抗原剂量的增加而逐步增加，当达到峰值后，反应吸光度随着抗原剂量的进一步增加反应降低，而达到峰值的抗原浓度主要取决于试剂中抗体的用量以及测定仪器的吸光度量程范围。抗原抗体反应这一独特的现象就是众所周知的钩状效应［5］，可以用“Heidel berger曲线”来描述［6］，曲线左侧为抗体过剩的测定区，称为前帯，中间为抗体抗原浓度大致相等的等当量区，称为等价带，右侧为抗原过量区，为后带。因此，高剂量抗原使强阳性的标本误测为弱阳性，甚至假阴性结果［6］，严重影响临床标本测定结果的准确性。研究抗原抗体反应体系中抗原过量状态是免疫比浊法试剂开发及临床应用中必须重视的问题。

2.2不同抗体用量配制CysC试剂抗原过量分析：从图1中可以得出，当抗体用量为50mg/L时，剂量反应曲线达到峰值时的抗原浓度为12mg/L，而随着抗体用量的增加，剂量反应曲线达到峰值的抗原浓度值逐渐升高，当抗体浓度为100mg/L和120mg/L时，达到吸光度峰值的抗原浓度值相同，均为22mg/L，但当继续增加抗体的用量至150mg/L时，剂量反应曲线达到峰值时的抗原浓度值反而下降为18mg/L，这是因为此时反应吸光度达到了2.5Abs.，已超出了生化分析仪吸光度测定量程的上限，仪器无法准确测定；各抗体用量所配制试剂抗原过量情况见表1。

表1不同抗体用量配制试剂抗原抗体剂量反应曲线峰值处抗原浓度及反应吸光度

2.3 CysC试剂抗体用量的确定：从以上实验结果可以得出，当抗体浓度为100mg/L和120mg/L时，剂量反应曲线达到峰值时的抗原浓度值相同，但在抗体浓度为120mg/L时，峰值处的吸光度值过高，超出了生化分析仪的吸光度测定量程，测定结果准确度无法保证，部分型号的仪器还会出现吸光度超限的报警而无法给出结果；综合试剂各项性能指标，该产品的线性范围为0～8mg/L，健康成人血清胱抑素C的参考区间在0.59～1.03mg/L［4］，临床上肾病患者的血清胱抑素C浓度水平在22mg/L以上的几乎不可见，当试剂盒的抗体用量为100mg/L可满足临床需求，因此本研究最后确定试剂中胱抑素C的抗体用量为100mg/L。

3结论

免疫比浊类试剂在研制开发过程中，在满足产品注册标准的同时还应充分进行抗原过量研究，根据研究结果加入足量抗体，为临床提供优质试剂；同时通过对所研制试剂抗原抗体剂量反应曲线的分析，精确掌握试剂出现抗原过量的浓度值，在临床应用过程中给予客户正确的指导，从而尽可能避免因高浓度标本测定结果的不准确而造成误诊。

参考文献

［1］唐红梅，姜振伟.胱抑素C的临床应用［J］.国际检验医学杂志，2011，32（2）：216-218.

［2］李黎．3项肾小球滤过率内源性标志物的临床应用评价［J］．国际检验医学杂志，2012，33（2）：170-171．

［3］Delanaye P，Nellessen E，Cavalier E，et al．Is cystatin C useful for the detection and the estimation of low glomerular filtration ratein heart transplant patients［J］．Transplantation，2007，83（5）：641-644．

［4］尚红，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程（第4版）［M］.人民卫生出版社，2015：311.

［5］滕晓梅.免疫比浊法用于全自动生化分析仪中产生钩状效应的防范［J］.国际检验医学杂志，2015，36（12）：1649-1650.

［6］彭凤.免疫透射比浊测定技术的进展和分析特性［J］.检验医学，2012，27（4）：252-255.

中图分类号：R446.1

文献标识码：A

文章编号：1672-8351（2016）07-0013-02