王卉，邵东旭，何节玉，孙宏元（琼州学院食品科学与工程系，海南三亚572022）



Nisin复合微粒的制备及其抗菌稳定性的研究

王卉，邵东旭，何节玉，孙宏元
（琼州学院食品科学与工程系，海南三亚572022）

摘要：乳酸链球菌素（Nisin）在应用中生物活性受到许多化学和物理因素的影响，采用壳聚糖（CS）/果胶（PE）复合凝聚物对Nisin进行包埋，研究反应的条件及复合微粒的形态结构，并考察包封Nisin经高温和胰蛋白酶处理后的抗菌稳定性。试验结果表明：在pH6、CS/PE质量比0.6、Nisin浓度1.5%时，Nisin包封率为87.3%，果胶的羧酸和壳聚糖的氨基通过静电相互作用，包封Nisin的颗粒基本成球形，大小约在100 nm～800 nm之间。经120℃处理20 min后，包封Nisin抗菌率是游离Nisin的4倍。当胰蛋白酶与Nisin反应10 min后，游离的Nisin抗菌率只有5%，而包封Nisin抗菌率仍有73%，反应60min后，抗菌率还有29%，说明CS/PE壁材对Nisin的抗菌性起到很大的保护作用。

关键词：乳酸链球菌素；果胶；壳聚糖；抗菌稳定性

乳酸链球菌素（Nisin）对大部分革兰氏阳性细菌和芽孢的生长和繁殖有抑制作用，是公认的高效、无毒的天然食品防腐剂，能有效延长产品货架期，因此受到越来越多的重视［1］。但Nisin在应用中存在稳定性差，生物活性受到许多化学和物理因素的影响，如温度、pH值和盐等，并能与食品中的蛋白质、脂肪、酶等组分发生反应［2-3］，导致Nisin抑菌能力降低。Nisin被用于鲜肉防腐，会受到肉中蛋白酶的分解，需增加添加量才能达到保鲜效果［4］。包埋技术能有效地解决Nisin稳定性的问题，包封壁材能降低食品生产加工过程中不同环境对Nisin的破坏，保证Nisin抑菌性能。主要的包封材料有脂质体［5］，海藻酸钠［6］、聚乳酸［7］和壳聚糖［8］等。

基于静电相互作用的聚电解质复合反应是发生在两种或两种以上大分子之间的的自聚集现象，若体系中同时存有被包埋的芯材物质，可形成包埋微粒［9］。其包埋方面的特性能保护和控制释放有效成分，提高产品品质，被广泛应用于农业、生物技术、食品调味品、生物医药、化妆品以及纺织品等领域［10］。目前使用的天然聚阳离子主要有壳聚糖（CS）、多肽等，聚阴离子主要是天然多糖，如海藻酸钠、阿拉伯胶、果胶、聚阴离子纤维素、硫酸葡聚糖等。

本论文利用壳聚糖为聚阳离子，低酯果胶为聚阴离子制备包封Nisin的复合微粒，考察反应条件对形成复合物的影响，研究包封Nisin的抗菌稳定性。

1　材料与方法

1.1材料与设备

壳聚糖（脱乙酰度≥95%）：广东省齐云生物技术有限公司；低酯果胶（酯化度30%～40%）：浙江衢州果胶有限公司；乳酸链球菌肽（食品级）：浙江新银象生物工程有限公司；胰蛋白酶（食品级，活力10 000 IU/g）：郑州鸿祥化工有限公司；其他试剂均为分析纯。

UV2550紫外可见分光光度计、IRAffinity-1傅立叶变换红外光谱仪：日本岛津；PHS-2C酸度计：金坛市盛蓝仪器制造有限公司；HitachiH-600透射电子显微镜：日本日立公司。

1.2方法

1.2.1CS/PE最佳质量比的测定

配制浓度为1 mg/mL果胶的水溶液，浓度1 mg/mL的壳聚糖溶液用0.5%的醋酸配制，在20℃下，边搅拌边将壳聚糖溶液逐滴加入果胶溶液中，于500 nm处测定溶液吸光度随果胶滴加量的变化，该波长下壳聚糖和果胶均没有吸收，确定最佳CS/PE的质量比。

1.2.2pH对形成CS/PE复合物的影响

分别调节果胶水溶液（5 mg/mL）与壳聚糖醋酸溶液（5 mg/mL）的pH为2、3、4、5、6、7，按最佳质量比将壳聚糖加入到果胶溶液，反应10 min，将复凝聚产物超速离心，过滤沉淀，干燥，计算复凝聚反应的产率，以反应产率为评价指标找出最佳的反应pH值。

1.2.3Nisin/CS/PE复合微粒的制备和测定

1.2.3.1Nisin/CS/PE复合微粒的制备

分别调节果胶水溶液（5 mg/mL）与壳聚糖醋酸溶液（5 mg/mL）至最佳反应pH值，在壳聚糖溶液中加入吐温80（壳聚糖添加量的5%）和Nisin（Nisin的浓度为0.5%、1.0%、2.0%），搅拌均匀，制备Nisin乳液。将Nisin乳液和果胶溶液同时滴加到搅拌的蒸馏水中，滴加完成后继续反应10 min，所得Nisin/CS/PE分散液置于4℃下待用。

1.2.3.2Nisin包埋率的测定

将Nisin/CS/PE分散液离心分离，取上清液，采用考马斯亮蓝法［11］检测上清液中Nisin的量来计算包封率。

1.2.3.3红外光谱测定

将样品置于红外干燥箱中除水干燥后，与KBr混匀研磨成粉状，压片，用IRAffinity-1傅立叶变换红外光谱仪测定，以空白KBr为背景于400 cm-1～4 000 cm-1间扫描。扫描次数为30次，分辨率为4 cm-1。

1.2.3.4电子透射电镜

将少量Nisin/CS/PE分散液直接滴在铜网上，待水分基本挥发干净后，磷钨酸染色。用滤纸吸走多余的染体，自然干燥，用透射电子显微镜（HitachiH-600）观察纳米粒子的形态和大小。

1.2.4温度对Nisin抗菌能力的影响

配制浓度250 μg/mL、pH 6的Nisin水溶液，用水稀释Nisin/CS/PE分散液使Nisin浓度为250 μg/mL，将Nisin水溶液和包封Nisin的分散液分别在不同温度（60、90、120℃）下保持20 min，测定抗菌率。

1.2.5胰蛋白酶对Nisin抗菌能力的影响

在Nisin水溶液和包封Nisin的分散液（浓度为250 μg/mL，pH 6）中加入20 μg/mL的胰蛋白酶，于37℃，200 r/min摇床振荡10、30、60、90 min，反应结束后在100℃灭酶10 min，测定抗菌率。

1.2.6Nisin抗菌率测定

制备营养琼脂培养基平板，在10mL适宜菌含量的金黄色葡萄球菌菌液中，分别加入0.2mL处理的Nisin水溶液和包封Nisin的分散液（浓度为250 μg/mL，pH 6），混合均匀后，取出0.2 mL涂布于平板上培养，各制备3个平板，37℃培养18 h～24 h。观察并记录各平板的菌落个数，取平均值。

2　结果与讨论

2.1CS/PE最佳质量比的测定

溶液吸光度与CS/PE质量比的关系如图1所示。

图1　CS/PE质量比对溶液吸光度的影响Fig.1　Effect of CS/PE ratio on absorbance of solution

两种聚电解质在溶液中发生复凝聚反应时，形成复合物分散液，其吸光度升高，因此可根据溶液吸光度的变化来确定复合反应的进行程度。当CS/PE的质量比在0～0.6之间变化时，随着壳聚糖含量增加，吸光度上升，这是由于果胶分子链上的带负电的羧基与壳聚糖带正电的氨基基团相互作用，生成疏水性的聚电解质复合物，0.6是这个曲线变化的拐点也是曲线最高点，表明溶液中所含的离子量最少，反应最充分，是最佳的质量比。当超过0.6后，由于溶液被稀释，吸光度逐渐降低。

2.2pH值对复合过程的影响

当CS/PE质量比为0.6时，复合产率随pH值的变化如表1所示。

表1　pH值对CS/PE复合物产率的影响Table 1　Effect of pH on the yield of CS/PE complex

由表1可知，pH为5～6时，凝聚产率最高，达92.1%，说明壳聚糖中氨基和果胶上羧酸之间的静电作用最强。当pH值降低时，由于果胶中羧酸离解程度变弱，电荷密度降低，产率逐渐降低，当pH值增大呈碱性时，壳聚糖中氨基不能被质子化，与果胶不能形成复合粒子。

2.3CS/PE和Nisin/CS/PE复合物的红外光谱分析

图2为壳聚糖、果胶和CS/PE的红外光谱图，图3 为CS/PE、Nisin和Nisin/CS/PE的红外光谱图。

图2　CS、PE和CS/PE的红外光谱图Fig.2　FTIR of CS、PE、CS/PE

由图2可见，壳聚糖在1 647 cm-1附近的吸收峰是氨基N-H键的弯曲振动，果胶在1 745 cm-1处的吸收峰为半乳糖醛酸羧基形成的酯键中羰基的伸缩振动；1 620 cm-1处的吸收峰为游离的羧酸中羰基的不对称伸缩振动，在CS/PE中，壳聚糖氨基峰向低波数移动至1 640 cm-1，果胶中酯键羰基吸收峰减弱，1 628 cm-1处离子化的羧基峰消失，表明壳聚糖和果胶通过离子键进行反应。

图3中Nisin的主要吸收峰1630cm-1和1539cm-1相应于Nisin中酰胺I和II键，在Nisin/CS/PE中也有出现，表明Nisin包裹在复合物中。

2.4Nisin浓度对复合物包封率的影响

不同Nisin浓度对包封率的影响见表2。

图3　CS/PE、Nisin和Nisin/CS/PE的红外光谱图Fig.3　FTIR of CS/PE、Nisin和Nisin/CS/PE

表2　不同Nisin浓度对包封率的影响Table 2　The effect of Nisin concentration on encapsulated efficiency

由表2可知，在Nisin浓度为1.5%时，Nisin/CS/PE复合物中Nisin的包封率最高，达87.3%，在Nisin浓度很低的情况下，由于溶液中Nisin分子数少，增加了聚电解质在形成过程中对Nisin分子的“捕捉”难度，造成对目标物分子的包封率小。当Nisin浓度超过1.5%时，包封率又有所下降。

2.5Nisin/CS/PE复合物的形态

Nisin/CS/PE复合物的透射电镜图如图4所示。

图4　Nisin/CS/PE复合物的透射电镜图Fig.4　TEM image of Nisin/CS/PE complex

图4为透射电镜下观察到的Nisin/CS/PE复合物的形态，由图中可见，复合物颗粒的形状基本成球形，大小不是很均一，颗粒之间无明显团聚现象，表明体系较稳定，大小大约在100 nm～800 nm。

2.6温度对Nisin抗菌能力的影响

温度对Nisin抗菌能力的影响如图5所示。

图5　温度对Nisin抗菌能力的影响Fig.5　Effect of temperature on the antibacterial activity of Nisin

由图5可知，随着处理的温度升高，Nisin的抗菌率逐渐降低，经60℃处理20 min，包封Nisin和游离Nisin的抗菌性基本相同，温度升高对包封Nisin的抗菌率影响不大，经120℃处理20 min，仍有65%，而游离Nisin的抗菌率显著降低到15%。说明CS/PE壁材对Nisin的抗菌性起到很大的保护作用。

2.7胰蛋白酶对Nisin抗菌率的影响

胰蛋白酶对Nisin抗菌率的影响如图6所示。

图6　胰蛋白酶对Nisin抗菌率的影响Fig.6　Effect of trypsin on the antibacterial activity of Nisin

由图6可知，当胰蛋白酶与Nisin反应10 min后，游离的Nisin抗菌率只有5%，而包封Nisin抗菌率仍有73%，随着反应时间的延长，包封Nisin抗菌率逐渐降低，在60 min时，抗菌率剩下29%。由于Nisin是多肽，对蛋白酶很敏感，游离的Nisin与胰蛋白酶反应后很快失去抗菌性，而包封Nisin由于受到CS/PE壁材的保护，所以能保持一定的抗菌活性，但在反应60 min后，抗菌性也大大降低。

3　结论

带负电荷果胶与带正电荷壳聚糖在进行复合反应能对Nisin进行有效的包埋，提高了Nisin的抗菌稳定性，复合反应产率受反应条件的影响，在pH 6、CS/ PE质量比0.6、溶液中Nisin浓度1.5%时，生成的复合物对Nisin的包封率为87.3%，果胶的羧酸和壳聚糖的氨基通过静电相互作用，包埋Nisin颗粒基本成球形，大小约在100 nm～800 nm之间。温度和蛋白酶能降低Nisin的活性，包封的Nisin稳定性大于游离的Nisin，经高温和胰蛋白酶的处理，游离Nisin的抗菌率损失很大，而包封Nisin仍具有较强的抗菌性。说明CS/PE壁材对Nisin的抗菌性起到很大的保护作用。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.003

基金项目：国家自然科学基金资助项目（51363018）

作者简介：王卉（1968—），女（汉），教授，博士，研究方向：天然大分子和食品保鲜。

收稿日期：2015-05-13

Studies on Preparation of Nisin Complex Particles and Antibacterial Stability

WANG Hui，SHAO Dong-xu，HE Jie-yu，SUN Hong-yuan

（Department of Food Science and Technology，Qiongzhou University，Sanya 572022，Hainan，China）

Abstract：The biological activities of Nisin are affected by many chemical and physical factors.Nisin was encapsulated in the complex of chitosan（CS）and pectin（PE）.The reaction conditions，structure and morphology of the complex were studied.The antibacterial stabilities of encapsulated Nisin were measured after high temperature and trypsin treatment.The results showed that the encapsulation effect of Nisin was 87.3%in pH6 with 0.6 of the CS/PE ratio and 1.5%of Nisin concentration.Carboxyl groups on pectin and amino groups on chitosan react by electrostatic interactionsand particle sizesof Nisin/CS/PE complex range from 100 nm to 800 nm with spherical shape.The antibacterial rate of the encapsulated Nisin was four times that of free Nisin after treatment for 20 min at 120℃.After reaction with trypsin for 10 min，the antibacterial rate of free Nisin only left 5%，while that of encapsulated Nisin was 73%，and remained 29%after 60 min.The results demonstrated that wall material CS/PE had great protective effect on the antibacterial rate of encapsulated Nisin.

Key words：Nisin；pectin；chitosan；antibacterial stability