赵丽丽，陆涛峰，张晓萍，牛银杰，陈洪岩*

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨 150001）



无特定病原体金定鸭微卫星DNA遗传多样性分析

赵丽丽#，陆涛峰#，张晓萍，牛银杰，陈洪岩*

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨 150001）

【摘要】目的 利用微卫星标记对无特定病原体金定鸭群进行遗传多样性分析。方法 采用微卫星标记，对SPF金定鸭种群中71个个体进行遗传多样性分析。结果 SPF金定鸭种群中17个位点上共检测到119个等位基因，每个微卫星上等位基因数介于3～13；该SPF金定鸭群体中有13个位点（PIC＞0.5）呈现出高度多态，平均杂合度为（0.5816±0.0142），其他位点均呈现出中度多态。仅有5个位点处于Hardy-Weinberg平衡状态，其余12个位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡，达到极显著水平（P＜0.01）。结论 该SPF金定鸭群体内均存在丰富的遗传多样性，满足建立封闭群的遗传特征，可以利用该群体继续开展无特定病原体金定鸭封闭群的建立。

【关键词】SPF金定鸭；遗传多样性；微卫星标记

金定鸭是我国著名的蛋鸭地方品种，因其产蛋量高、体型小、饲料利用率高、杂交利用效果明显、适应性强等优点而驰名中外［1-2］。哈尔滨兽医研究所实验动物中心从国家水禽种质资源基因库江苏省丰达水禽育种场引进祖代金定鸭种卵，从孵化开始在屏障环境下进行病原微生物的净化。自1日龄起直至淘汰，全部生命周期都饲养于隔离器中，已经排除了高致病性禽流感病毒、鸡新城疫病毒、禽腺病毒Ⅲ群、番鸭细小病毒、禽减蛋综合征、鹅细小病毒、鸭瘟病毒、I型鸭肝炎病毒、鸭圆环病毒和鸭坦布苏病毒等十种病原体，初步培育出无特定病原体金定鸭F0代核心群。为了了解该群的遗传多样性状况，以便采取更有效的保种措施及更好地开发利用，本研究采用微卫星DNA技术，选用17个极其高度多态且

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

本试验共采集了中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心保存的无特定病原体金定鸭71只，61周龄【SCXK（黑）2011-007】，翅静脉采血。所有动物经过高致病性禽流感病毒、鸡新城疫病毒、禽淋巴白血病病毒、番鸭细小病毒、禽减蛋综合征、鹅细小病毒、鸭瘟病毒、I型鸭肝炎病毒、鸭圆环病毒和鸭坦布苏病毒等十种病原体检测，均呈阴性，微生物检测内容在本文中没有涉及。

1.1.2 PCR相关试剂

TaqDNA聚合酶、dNTPs及100 bp DNA ladder均购自大连宝生物有限公司。

1.1.3 微卫星引物

参照文献报道，选择了17对微卫星标记用于鸭的遗传多样性分析［3，5，8］。为了实现微卫星多态性的荧光半自动检测，对引物进行了荧光修饰，本研究选择了适用于ABI3130XL下光栅CCD荧光检测系统的三种荧光集团，即 FAM（蓝色）、HEX（绿色）、和LIZ（橙色），其中LIZ为分子量内标。所用引物和组合见表1。

表1 17个鸭微卫星位点的相关信息Tab.1 The information of 17 microsatellite loci in the ducks

1.2 方法

1.2.1 血液基因组DNA的提取采用常规的酚氯仿抽提法

1.2.2 PCR扩增

PCR总反应体积为25 μL，其中10×PCR buffer、dNTP、Taq酶按照不同试剂盒的推荐量加入，上下游引物（100 pmol/μL）各1 μL，基因组DNA：1 μL，用纯水（ddH2O）补足体系到25 μL。

PCR反应程序为：94℃预变性，3 min；94℃变性，40 s；退火温度（各位点退火温度参见表 B），40 s；72℃延伸，40 s；30个循环；72℃继续延伸5 min；扩增产物4℃保存。

1.2.3 PCR产物的检测

PCR产物，经1.5%的琼脂糖凝胶电泳以及凝胶成像系统拍照检测扩增结果。

1.2.4 扩增产物的STR扫描

扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳检测确保扩增出目的片断后，选择分别以FAM、HEX、TAMRA标记的三个位点的扩增产物，以1∶1.5∶1.5体积比混合，取1 μL上样进行STR扫描。荧光引物合成和STR扫描均由金唯智公司完成。

1.2.5 数据分析

本研究中采用Excel Microsatellite Toolkit（version 3.1）软件计算群体内各位点的等位基因数（Na）和多态信息含量（PIC）、群体的期望杂合度（He）和观察杂合度（Ho）；利用GENEPOP version 3.4软件进行Hardy-Weinberg平衡检验。

2 结果与分析

2.1 等位基因及基因频率

该金定鸭群体在17个微卫星位点上的等位基因及等位基因频率情况如表2所示。结果表明，金定鸭群体在17个位点上共检测到119个等位基因，所有位点中等位基因数最多的为13个，最少的为3个。大部分位点上检测到的等位基因数都接近于文献报道［5，10］。每个位点上存在一个或极少数优势等位基因，这些优势等位基因可能是品种间或种内较为保守的等位基因，同时在部分位点也存在一些低频率的等位基因，依据文献报道［3，5，8］我们选取的微卫星全部为二核苷酸重复序列，但在许多位点上检测到了单碱基的差异，说明在这些位点的侧翼序列中可能存在着一定程度的单核苷酸多态性。

2.2 杂合度、多态信息含量及有效等位基因数

17个微卫星位点在金定鸭群体中的多态信息含量（PIC）、群体的期望杂合度（He）和观察杂合度（Ho）见表3。结果表明，该金定鸭群体中有13个位点（PIC＞0.5）呈现出高度多态，平均杂合度为（0.5816±0.0142），其他位点均呈现出中度多态。上述信息均表明群体内遗传多样性较高，各位点多态性较好，遗传多样性水平基本相当。依据Botstein等首先提出的衡量基因变异程度高低的多态信息含量（PIC）指标，表明所选位点具有较高的多态性，适于鸭的遗传学分析。

2.3 Hardy-Weinberg平衡

使用GENEPOP软件对金定鸭群体中17个微卫星位点的Hardy-Weinberg平衡状态进行检验，统计结果如表4所示。结果显示，仅有5个位点处于Hardy-Weinberg平衡状态，其余12个位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡，达到极显著水平（P＜0.01），表明该群体在培育过程中受到明显的选择效应，与该群体的遗传背景相符合。

综上所述，该SPF金定鸭群体在所选的17个微卫星位点上表现出较高的多态性，表明这些位点能用于封闭群金定鸭遗传质量评价。同时，该群体在一些位点上表现出偏离哈代-温伯格平衡的现象，表明该群体在培育过程中受到了人工选择的压力，这也与该群体的遗传背景相一致。因此，该群体经过基于微卫星标记的遗传质量检测，表明该群体符合封闭群的遗传特征，可以利用该群体继续开展无特定病原体金定鸭封闭群的建立。

3 讨论

微卫星DNA（microsatellite）是上世纪80年代末发展起来的一种新型遗传标记。由于其具有在基因组中分布广泛、多态性高、易于检测、共显性遗传等优点，因此在评价遗传多样性、构建遗传连锁图谱、绘制系统发生树、疾病诊断和亲子鉴定方面显示出巨大优势，并在动植物的遗传研究中得到了广泛应用［7，8］，同时也被作为一种重要、成熟的遗传学检测工具广泛应用于各类实验动物遗传质量检测研究中［9，10］。目前，微卫星DNA扩增产物的电泳分型方法有琼脂糖电泳、聚丙烯酰胺电泳和毛细管电泳等。毛细管电泳技术是将荧光标记的PCR产物和标准分子量样品（内参）在同一毛细管中进行电泳，DNA分析仪将结果自动记录在计算机上，利用片段分析软件进行图像收集和分析，精确计算出微卫星等位基因片段的大小。毛细管电泳检测PCR产物具有微量、高度自动化、结果更加准确等明显优势，是微卫星检测的发展方向。

表2 17个鸭微卫星位点等位基因数及等位基因频率Tab.2 Allele size and corresponding frequencies at 17 microsatellite loci in the ducks

本研究利用毛细管电泳技术，建立了SPF金定鸭群体遗传质量研究的方法，该方法包含了17个鸭微卫星位点。通过对SPF金定鸭种群中71个个体的遗传多样性分析，共检测到119个等位基因，每个微卫星座位上等位基因数介于3～13个之间，大部分位点上检测到的等位基因数都接近于文献报道［2，11，12］。该SPF金定鸭群体中有13个位点（PIC ＞0.5）呈现出高度多态，平均杂合度为（0.5816±0.0142），其他位点均呈现出中度多态，仅有5个位点处于Hardy-Weinberg平衡状态，其余12个位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡，达到极显著水平（P＜0.01）。结果表明，该SPF金定鸭群体在所选的17个微卫星位点上表现出较高的多态性，说明这些位点能用于封闭群金定鸭遗传质量评价。同时，该群体在一些位点上表现出偏离哈代-温伯格平衡的现象，表明该群体在培育过程中受到了人工选择的压力，这也与该群体的遗传背景相一致。

表3 17个鸭微卫星位点遗传变异参数Tab.3 Genetic variations at 17 microsatellite loci in the ducks

表4 17个鸭微卫星位点的Hardy-Weinberg平衡状态Tab.4 Hardy-Weinberg equilibrium test of 17 microsatellites in the ducks

综上所述，本研究对利用微卫星DNA标记对培育的无特定病原体金定鸭种群的遗传多样性进行了遗传质量检测，表明该群体符合封闭群的遗传特征，可以利用该群体继续开展无特定病原体金定鸭封闭群的建立。从而可以为后期实验动物无特定病原体金定鸭的培育的标准化、规模化和种子库的建立提供重要的遗传学数据和理论依据。

参考文献

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【中图分类号】Q95-33

【文献标识码】A

【文章编号】1005-4847（2016）03-0299-05

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.03.016

Corresponding author：CHEN Hong-yan，E-mail：chenhongyan@caas.cn.

［基金项目］中国农业科学院创新工程项目（2016350）。

［作者简介］赵丽丽（1983-），女，博士，助理研究员。研究方向：兽医微生物和免疫学。E-mail：zhaolili213@163.com；陆涛峰（1982-），男，博士，助理研究员。研究方向：动物遗传育种与繁殖。E-mail：taofenglu@126.com。#为共同第一作者。

［通讯作者］陈洪岩（1963-），男，研究员。研究方向：实验动物学。E-mail：chenhongyan@caas.cn.分布在不同连锁群上的微卫星标记，结合PCR和毛细管电泳技术，从分子水平对该群无特定病原体金定鸭的遗传多样性进行了研究，以期获得该群体的遗传学参数，为SPF金定鸭封闭群的培育提供基础数据。

［收稿日期］2016-02-23

Analysis of the DNA genetic diversity in SPF Jinding duck population

ZHAO Li-li，LU Tao-feng，ZHANG Xiao-ping，NIU Yin-jie，CHEN Hong-yan*
（State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Harbin Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences（CAAS），Harbin 150001，China）

【Abstract】Objective To analyze the DNA genetic diversity in SPF Jinding duck population using microsatellite markers.Methods The DNA genetic diversity in 71 SPF Jinding ducks were analyzed by microsatellite markers.Results A total of 152 alleles were detected at 17 microsatellite loci，and the numbers of alleles at each locus varied from 3 to 13. Thirteen microsatellite loci showed a high level of average PIC values（PIC＞0.5），the hererozygosity（H）was 0.5816± 0.0142.Other loci showed a middle level of the average PIC values.Only 5 microsatellite loci were in Hardy-Weinberg equilibrium，although 12 microsatellite loci were not in（P＜0.01）.Conclusions The results revealed that the genetic variabilities in the SPF Jinding duck population are rich，and this population meets to the genetic characteristics of the closed colony animals，so it can be used to establish the closed colony of SPF Jinding duck.

【Key words】Jinding duck population；Genetic diversity；Microsatellite DNA