陕西省人民医院(西安 710068)

杨娣娣　韩秀蕊　胡淑玲　安　娜△　刘先宁△▲　魏绪仓



恶性血液病患者侵袭性真菌感染分子生物学诊断研究*

陕西省人民医院(西安 710068)

杨娣娣韩秀蕊胡淑玲安娜△刘先宁△▲魏绪仓

摘要目的: 了解恶性血液病患者发生侵袭性真菌感染(IFI)的菌种类别，为预防及临床治疗提供科学依据。方法: 收集疑似IFI的恶性血液病人痰、血液等标本,分离出真菌40株，采用半巢式基因扩增联合测序法进行鉴定，同时与培养后表型诊断结果进行对比分析。结果: 用基因扩增联合测序法40株真菌均鉴别出菌种，鉴定率为100%；用培养后表型法37株鉴定出菌种，3株尚未鉴定出菌种，鉴定率为92.5%。结论:采用基因扩增联合测序法可快速、准确的鉴别出恶性血液患者IFI的菌种类别。

主题词血液肿瘤/诊断细菌感染和真菌病分子生物学

近年来随着免疫抑制剂、细胞毒性药物、糖皮质激素及广谱抗生素在临床中的广泛应用，恶性血液病患者自身免疫力急剧下降，成为侵袭性真菌感染(Invasive fungal infections,IFI)的高危人群，病死率较高[ 1]。我们采用基因扩增联合测序方法对临床考虑IFI的恶性血液病患者痰液、血液等标本中分离的40株真菌进行鉴定，结果100%鉴别出菌种，同时与培养法进行对比研究，现报告如下。

材料和方法

1标本来源收集2012年2月至2015年6月陕西省人民医院及西安市第一医院拟诊为IFI的恶性血液病患者痰液、血液等标本98例份，沙堡弱琼脂平皿(SDA), 28°C(相对湿度46%)进行培养，其中有40例获得单个菌落。包括急性白血病26例，淋巴瘤8例，多发性骨髓瘤4例，噬血细胞综合征2例。

2真菌标准菌株白色假丝酵母菌(Candida albicans)、C54烟曲霉菌( Asperginius fumigatus)标准菌株,均购于陕西省微生物研究所菌种保藏中心，使用前进行传代培养，形态学确认。

3试剂与仪器真菌基因组DNA提取试剂盒，DNeasy Plant Mini Kit，购于德国Qiagen公司；2×Taq plus PCR MasterMix购于北京天根生化科技有限公司；DNA Marker购于大连TaKaRa生物工程有限公司；引物合成和PCR产物测序，由上海生工生物工程有限公司完成，引物序列,见表1。Mastercycler gradient PCR仪，购于德国Eppendorf公司；电泳仪和紫外分析仪，购于北京六一仪器厂。假丝酵母样菌显色培养基( 郑州安图生物工程股份有限公司 )。

表1　真菌18SrRNA ITS2区引物序列

4研究方法

4.1培养后丝状真菌的表形鉴定方法：将真菌菌株、菌落用无菌生理盐水制成菌液，接种沙堡弱琼脂平皿(SDA)28°C,培养7～10d。每日观察并记录菌落的形态、大小， 颜色，采用棉兰染色显微镜下观察菌丝、孢子形态，根据以上生物学表型特征综合分析进行鉴别诊断。

4.2酵母样真菌显色培养表型鉴定方法：将菌种接种于沙堡弱琼脂平皿(SDA),28°C，湿度46%，进行培养，获得单个菌落。挑取单个菌落，接种于显色培养基平皿内，置培养箱28°C，湿度46%培养，每天观察一次结果，根据菌落颜色进行菌种鉴定：菌落光滑奶油色到白色为光滑假丝酵母菌，紫红色边缘模糊有微毛为克柔假丝酵母菌，绿色、翠绿色为白色假丝酵母菌，灰蓝色、铁蓝色为热带假丝酵母菌。

4.3基因扩增联合测序分析鉴定方法[ 2-5]

4.3.1真菌DNA的提取：依次取标准及标本真菌单个菌落约5 mg置于5 ml离心管中, 采用加液氮研磨成为粉状, 再按照DNeasy Plant Mini Kit试剂盒说明书中的提取步骤进行，提取真菌基因组DNA，最终获得到(10～50)ng/μl的DNA溶液。

4.3.2进行半巢式PCR扩增真菌ITS2区：PCR引物采用通用引物序列,见表1。第一轮PCR扩增：总体积为20 μl，其中模板为提取的真菌DNA 2 μl，引物ITS1，ITS4各1 μl，2×premix Tag 10 μl，无菌去离子水6 μl；反应程序为95 ℃预变性5 min后, 95 ℃ 30 s ，55 ℃ 1 min ，72 ℃ 1 min共计35个循环， 72 ℃延伸6 min，4 ℃保存备用。第二轮PCR扩增：总体积50 μl，其中模板为第一轮PCR扩增反应产物2 μl，引物ITS86，ITS4各1 μl，2×premix Tag 25 μl，无菌去离子水21 μl；反应程序95 ℃预变性5 min后, 95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s ，72 ℃ 30 s共计35个循环， 72 ℃延伸6 min。扩增产反应物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后，送往上海生工生物工程有限公司进行DNA测序。

4.3.3序列比对与种属分析：测序结果在美国国立生物信息中心( NCBI)的BLAST工具与基因库中真菌核酸序列比对，确定其种属。

结果

1标准菌株鉴定结果标准烟曲霉菌、白色念珠菌菌株经培养后形态学确认采用基因扩增联合测序法进行鉴定，其结果与NCBI基因库中的真菌核酸序列比对，结果完全一致。

2真菌株鉴定结果从患者痰液、血液等标本中分离的40株真菌，采用基因扩增联合测序法鉴定，均鉴别到种，比率为40/40(100%),见表2。采用培养后表型法鉴定，37株鉴定到种，且与基因扩增联合测序法鉴定结果一致。有3株未能鉴定出菌种，比率为37/40(92.5%)。

表2　40株真菌采用基因扩增联合测序法鉴定出菌种类别及构成比

讨论

恶血性血液病患者继发真菌感染后，因缺乏特异性的临床表现，加之既往表型诊断方法的缺陷，如培养时间长，特异性差，以及长期用药等因素的影响，致使真菌形态变异难以鉴别其种属。导致病人延迟诊治，甚至感染致死。资料显示，恶性血液病合并IFI致死率高达60%[6]。IFI的发病率一直持续上升，特别是侵袭性曲霉菌感染(Invasive aspergilius,IA)病死率很高，对免疫力低下的恶性血液病患者来说，及时的诊断和治疗是提高患者生存质量和改善预后的关键。G试验(1,3-β-D葡聚糖检测)、GM试验(半乳甘露聚糖检测)的广泛开展给IFI、IA的抢先治疗提供了依据，但由于不能确定到菌种，临床为了避免复发，达到治愈的目的，常采取联合用药、疗程较长，增加了患者的经济负担。我们采用半巢式基因扩增联合测序法可以鉴定到菌种，使临床治疗更具有针对性，减少患者费用。

本研究采用基因扩增联合测序法对恶性血液病患者痰及血液等标本中分离的40株真菌进行鉴定，结果鉴定率100%。分析鉴定结果显示，曲霉菌居首位占50%，其次为酵母样菌占45%。在曲霉菌中，以烟曲霉菌为主占75%，黄曲霉菌占20%，土曲霉菌占5%。在酵母样菌中，白色假丝酵母菌据首位占50%。其次为光滑假丝酵母菌占28%，热带假丝酵母菌占11%，克柔假丝酵母菌占5.5%。以上鉴定结果和培养后表型鉴定结果相一致。另外采用该法还鉴定出挪威假丝酵母菌1株，绿色木霉菌一株，娄地青霉菌一株，而采

用培养法这几株菌均未鉴定出菌种。

随着恶性血液病治疗技术的不断进步,此类病人真菌感染的防治尤显重要。其关键是要做到早诊断、早治疗。基因扩增联合测序技术，是在聚合酶链反应基础之上，采用18SrRNA基因保守区ITS2区的通用引物进行扩增，而半巢式PCR扩增又极大地提高PCR反应的灵敏度，是一种特异性，灵敏度极高的早期实验室诊断方法，能早期发现微量样本中的病原体，弥补培养法耗时长、阳性率较低的不足；PCR扩增产物测序结果与NCBI数据库中的海量序列加以比对，从而鉴别诊断出真菌的种属，该方法能鉴别出绝大多数真菌种属，不受表型变异的影响。

我们认为PCR基因扩增联合测序法可快速、准确的鉴别出恶性血液病IFI的菌种类别，对IFI患者的早期诊断及治疗具有重要意义。

参考文献

[1]柴国伟，李旭东，陈晓阳，等.恶性血液病合并侵袭性真菌感染92例临床特点及疗效分析[J] .中国医师进修杂志，2014,37(13):51-53.

[2] 安娜，王亚妮，刘先宁，等. 真菌性角膜炎致病菌种属的PCR鉴定[J] .眼科新进展，2010,30(11)：1017-1020.

[3] Tuli SS. Fungal keratitis[J].Clin Ophthalmology, 2011，(5):275-279.

[4]刘先宁，胡淑玲，安娜，等. 半巢氏PCR扩增联合基因测序鉴定丝状真菌的实验研究 [J]. 现代检验医学杂志，2013，28(5):48-52.

[5]胡淑玲，安娜，刘先宁，等. 基因扩增联合测序法对痰标本分离的60株真菌病原学鉴定[J]. 陕西医学杂志，2014,43(11):1547-1549.

[6] 努尔阿米娜·依明尼亚孜,维尼拉·吐尔洪. 恶性血液病合并侵袭性真菌感染的治疗方案及临床分析[J].中国医药指南，2013,11(1)：562-563.

(收稿:2015-10-12)

通讯作者▲

【中图分类号】R392.1

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.07.07

Molecular biological diagnosis of invasive fungal infection in patients with malignant hematologic diseases

Shaanxi Provincial People's Hospital(Xi’an 710068)

Yang DidiHan XiuruiHu Shulinget al

ABSTRACTObjective:To understand the species of invasive fungal infection in patients with malignant hematological diseases, to provide scientific evidence for the prevention and treatment. Methods: The 40 strains of fungi isolated from the body fluid samples such as sputum, blood were identified by gene amplification and sequencing and then compared with the diagnosis from culture method. Results:The 40 strains of fungi were identified by gene amplification and sequencing, the rate of identification was 100%; 37 strains were identified by culture method, 3 strains couldn’t be identified, the rate of identification was 92.5%. Conclusion:The species of invasive fungal infection in patients with malignant hematological diseases can be identified quickly and accurately by gene amplification and sequencing method.

KEY WORDSHematologic neoplasms/diagnosisBacterial infections and mycosesMolecular biology

*陕西省社发攻关基金资助项目(2011K12-23)

西安市科技局项目[SF 09023(3)]

△西安市第一医院，陕西省眼科研究所