苏，周朝东，黄哲Δ，尉然

(1.天津市药品检验所 生化室，天津 300070；2.天津华立达生物工程有限公司，天津 300457)

荧光定量PCR法测定重组人干扰素α2b原液中宿主DNA的残留

(1.天津市药品检验所 生化室，天津 300070；2.天津华立达生物工程有限公司，天津 300457)

目的 建立重组人干扰素α2b原液中宿主DNA残留量测定的方法并进行验证,用于对该产品的质量控制。方法 通过wako DNA提取试剂盒提取干扰素原液中的宿主残留DNA，再利用SYBRGreen染料法对样品和标准DNA进行定量PCR测定，根据标准曲线对样品中的DNA残留量分析。对建立的方法进行引物特异性以及结果准确性和精密性的验证，同时对企业提供的3批干扰素原液中的残留DNA测定。结果 该方法检测假单胞菌基因组DNA的最低准确定量浓度可达12 fg/μL，DNA含量在12 fg/μL～120 ng/μL范围内线性良好，标准曲线的相关系数r=0.998； wako DNA提取试剂盒提取不同量的加标样品回收率均在50%～200%范围内；该方法检测3批干扰素原液的DNA残留量均低于标准限度，符合《中国药典》三部2010年版和2015年版中关于假单胞菌产重组人干扰素α2b原液中宿主DNA残留量的要求。结论 wako DNA提取试剂盒能解决干扰素原液中样品前处理的技术难点，与定量PCR法结合能够简便、快速、准确地对干扰素原液中残留的DNA定量测定。

wako DNA提取试剂盒；荧光定量PCR；假单胞菌；干扰素；DNA残留；质量控制

重组人干扰素α2b具有广谱抗病毒、抑制细胞增殖、提高机体免疫功能等作用[1-3]。《中国药典》三部2010年版和2015年版收载的干扰素制剂均由大肠杆菌、酿酒酵母和假单胞菌发酵产生[4-5]。天津华立达生物工程有限公司生产的重组人干扰素α2b即由假单胞菌携带能够产生人白细胞干扰素α2b基因的质粒发酵产生，临床主要用于治疗急慢性病毒性肝炎、带状疱疹、尖锐湿疣等。因宿主菌残留的DNA具有潜在的危害性，所以需要对发酵产物中的宿主残留DNA进行质量控制[6]。《中国药典》三部2010年版和2015年版对干扰素原液中宿主残留DNA量都作了规定，两版药典在该处的区别是2010年版要求原液中宿主DNA残留量不得超过10 ng/剂量而2015版则要求原液中宿主DNA残留量每支(瓶)不得超过10 ng。两版药典附录收载的宿主残留DNA检测方法也相同，都是2种方法：第一法是DNA探针杂交法，第二法是荧光染色法[7-8]。地高辛标记的探针法具有操作繁琐、耗时较长等缺点；而荧光染色法也存在灵敏度低的缺点[9-10]。现使用以SYBRGreen荧光染料为基础的荧光定量PCR法来检测重组人干扰素α2b原液中的宿主DNA残留量，该方法具有灵敏度高、准确性好、简便快速等优点，可用于假单胞菌发酵产生的重组人干扰素α2b生产过程中的质量控制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试品：3批干扰素原液由天津华立达生物工程有限公司提供。

标准基因组DNA：干扰素宿主菌假单胞菌由天津华立达生物工程有限公司提供，采用天根细菌基因组提取试剂盒提取，经微量紫外可见分光光度计测定浓度和纯度。

1.1.2 主要试剂及仪器：细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根公司，宿主残留DNA提取试剂盒wako DNA Extractor kit 购自日本wako公司。2×PowerSYBRGreen Master Mix购自美国ABI公司，微量紫外可见分光光度计NanoDrop购自美国Thermo公司，荧光定量PCR仪stepone购自美国ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 干扰素原液中宿主残留DNA提取：取不同批号的干扰素原液按wako DNA extractor kit说明书提取样品中的残留DNA。

1.2.2 q-PCR方法建立及标准曲线绘制：利用假单胞菌16sRNA的序列设计特异引物，引物序列如下：上游5′-CACG-CCGTAAACGATGTCAA-3′；下游5′-AGCTGCGCCACTAAAATCTCA-3′，引物序列由Invitrogen公司合成。反应体系中各成分的加入量为：上下游引物各10 μM各加入1 μL，2×PowerSYBRGreen Master Mix 10 μL，模板1 μL，超纯水 7 μL，总体系20 μL。反应条件为：95 ℃ 预变性10 min；95 ℃ 变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；72 ℃再次延伸5 min。取灭菌超纯水按10倍梯度稀释标准基因组DNA，浓度从120 ng/μL～0.12 fg/μL,以各浓度的DNA为模板行PCR扩增。以模板DNA浓度的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标绘制标准曲线，进行线性拟合，求出回归方程。每个浓度做3个复孔，每个样品亦做3个复孔。

1.3 方法学验证

1.3.1 引物特异性的验证：按1.2.2的方法配制标准曲线的PCR反应体系扩增，扩增完毕后做熔解曲线，若无杂峰则说明设计的引物特异性较好同时也说明选择退火的温度合适。

1.3.2 准确性及精密性验证：在干扰素原液批号为BD150102中分别加入1200、120、12 pg的基因组DNA标准品，采用DNA extractor kit提取总DNA后，进行q-PCR检测，并按下述公式计算加标回收率(%)，分析该方法的准确性。加标回收率(%)=(实际测定值-本底残留值)/加标理论值×100%

1.4 方法应用 用建立的q-PCR方法对3批干扰素原液的宿主DNA残留量测定。

2 结果

2.1 DNA标准品的浓度及纯度 经提取后测定，其浓度为120 ng/μL,纯度A260/A280为1.87。

2.2 q-PCR标准曲线及线性回归方程 标准曲线见图1，线性回归方程为：y=-3.6012x+40.035(r=0.998)，Ct值与模板DNA浓度的对数呈良好线性关系，相关系数为0.998。

图1 假单胞菌基因组DNA标准曲线Fig.1 Standard curve of pseudomonas genome DNA

2.3 方法学验证

2.3.1 引物特异性的验证：在q-PCR扩增不同浓度的标准DNA做标准曲线时给荧光定量PCR仪设置熔解曲线步骤，实验证明除主峰之外无杂峰，证明引物特异性良好，退火温度适当，符合实验要求。熔解曲线见图2。

图2 熔解曲线分析Fig.2 Analysis of melt curve

2.3.2 准确性及精密性验证：干扰素原液的加标回收率在q-PCR可接受范围内(50%～200%)，不同浓度加标回收率的变异系数均在20%以内。见表1。

表1 干扰素原液不同加标量样品的回收率

2.4 方法应用 检测结果显示，干扰素原液中宿主DNA残留量均远低于10ng/剂量，符合《中国药典》三部(2010年版)的相关要求。见表2。

表2 干扰素原液中宿主DNA残留量的测定结果

3 讨论

生物制品的质量控制不仅是对终产品的质量控制，更是对整个生产过程的质量控制。生物制品在生产过程中宿主残留的微量DNA本身可引起人体免疫反应[11-13]，因此，如何选择灵敏度高、准确性好、简单快速的方法对生产过程中的宿主残留DNA进行质量控制便成为提高产品质量的重要一环。

16sRNA是微生物的核糖体RNA，在进化过程中保持相对恒定的序列信息。因此常被用来设计特异性引物以进行微生物种属的鉴别[14]。本研究参考相关文献[15-18]利用假单胞菌的16sRNA为序列设计特异性引物后通过基于SYBRGreen染料的荧光定量PCR，最终根据荧光信号的强度来确定干扰素原液中宿主残留的DNA量。

《中国药典》三部2010年版和2015年版收载的宿主残留DNA测定方法有2种，分别是DNA探针杂交法和荧光染色法，二者都存在灵敏度低，操作繁琐、耗时较长等缺点[16-17]。荧光定量PCR法则具有灵敏度高、准确、快速等优点，是实现生物制品中宿主残留DNA测定的最佳方法。目前定量PCR方法尚无统一的验证接受标准，因PCR产物的量呈2n增长，每增加1个循环，产物量即在原有的基础上增加1倍，因此回收率的计算应按理论值±2x倍评价，通常最大可接受回收率标准应设定在理论值±21倍，即±1个循环(50%～200%)[14]。

宿主残留DNA属于微量杂质，测定时干扰因素多。为确保干扰素原液中残留DNA能够被有效提取，本文经过对比，采用了美国药典推荐的wako DNA extractor kit，其提取回收率符合要求。在实验过程中还采用了磁珠提取试剂盒对干扰素原液进行提取，其回收率亦符合要求，只是对操作人员的技能要求较高，且实验花费较大，因此笔者倾向于选择wako公司生产的DNA纯化试剂盒。经实验，3批干扰素原液中的宿主DNA残留量均远远低于10ng/剂量的标准，符合《中国药典》的要求。综上所述，本文建立的检测方法可作为假单胞菌产重组人干扰素α2b原液中宿主DNA残留量测定的常规检测方法。

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(编校：王俨俨)

Determination of residual host cell DNA in recombinant human interferon α2b substances by quantitative PCR

SU Zhe1, ZHOU Chao-dong1, HUANG Zhe-su1Δ, WEI Ran2

(1.Biochemical Lab, Tianjin Institute for Drug Control, Tianjin 300070, China; 2.Tianjin Hualida Biotechnology Co., Ltd, Tianjin 300457, China)

ObjectiveTo develop and verify a method for determination of residual host cell DNA in recombinant human interferon α2b substances, which is used for the quality control of the product.MethodsThe residual host cell DNA was extracted by wako DNA extractor kit and determined by SYBRGreen based q-PCR using standard DNA as control. The residual host cell DNA was analyzed according to the standard curve. The developed method was verified by primer specifity, results accuracy and precision and used for determination of 3 batches of interferon substances.ResultsThe minimum quantitative limit of residual host cell DNA by the developed method was 12 fg/μL, while the linear range was 12 fg/μL-120 ng/μL, with a correlation coefficient (r) of 0.998. The designed primers were specific to the DNA templates. The recovery rates of spiked samples with different DNA quantity were between 50%-200%. The residual host cell DNA determined by this method were not more than the limit, which were complied with the requirements for residual host cell DNA in Chinese Pharmacopeia (volume III,2010 edition and 2015 edition).ConclusionThe wako DNA extractor kit could successfully solved the technical difficulties of sample pretreatment during residual DNA assay. The q-PCR method was simple, rapid and accurate for quantitation of residual host cell DNA in interferon substances.

wako DNA extractor kit; quantitative PCR(q-PCR); pseudomonas; interferon; residual DNA；quality control

苏喆，女，硕士，研究实习员，研究方向：生化药品检验与研究,E-mail：marilyn66@163.com；黄哲甦，通信作者，女，本科，主任药师，研究方向：生化药品检验与研究，E-mail：zcd82@163.com。

R917

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.04.61