黄依蓝++岳倩倩++倪爱新

摘要：利用稀释平板法和基于ITS rDNA基因序列的分析方法对宽阔水自然保护区3种类型的土壤进行真菌的分离鉴定，共分离得到353株真菌，归为34个不同的属。对土壤真菌多样性进行评估，结果表明：紫色土真菌优势属为酵母菌属（Saccharomyces），黄棕壤真菌优势属为酵母菌属（Saccharomyces）和被孢霉属（Mortierella），黄壤真菌优势属为青霉属（Penicillium）和木霉属（Trichoderma）。土壤真菌Margalef丰富度指数（R）最高的是黄壤，最低的是黄棕壤；Shannon-Wiener多样性指数（H′）最高的是紫色土；Pielou均匀度指数（J）黄棕壤最高；Jaccard相似性指数（Cj）为0444 ～0.536，表明3种类型土壤的真菌多样性均具有一定差异。

关键词：宽阔水；土壤真菌；多样性

中图分类号： S154.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0458-03

收稿日期：2015-11-22

基金项目：国家科技基础性工作专项（编号：2014FY120100）。

作者简介：黄依蓝（1992—），女，硕士研究生，主要从事土壤真菌资源研究。E-mail：ylhuang77@163.com。

通信作者：周礼红，博士，副教授，主要从事微生物应用方向的研究。E-mail：lhzhou33@126.com。宽阔水自然保护区位于贵州省遵义市绥阳县境内，总面积26 231 km2，海拔在650～1 762 m之间，地形切割强烈，除中南部以中低山谷地为主的侵蚀地貌外，保护区东、西部及北部多为典型的喀斯特地貌。宽阔水保护区的森林植被主体为亮叶水青冈林与常绿阔叶树种构成落叶常绿阔叶混交林，林下土壤发育良好，具有较丰富的腐殖质积累[1]。由于特殊的气候及地质土壤条件，宽阔水自然保护区为森林野生动植物及微生物的生长繁育提供了有利的栖息场所，形成了复杂多样的生境类型。与动植物的分布类似，微生物的分布是确定性（环境）和随机性（扩散）的共同结果。由于微生物个体较小，可以通过孢子抵御长距离传播中的不良环境，在适宜条件下以多种繁殖方式存活下来，这种巨大的分散潜力和对小环境的敏感性，是微生物群落结构与大型生物群落结构之间的区别。土壤真菌作为微生物群落结构中的一个重要组成部分，其多样性程度与土壤肥力和生态状况密切相关，同时生态系统的物质循环及环境变化，也直接影响到真菌物种多样性和空间分布情况[2-4]。

本研究采用传统分离方法对宽阔水自然保护区3种不同土壤的真菌多样性进行调查，结合微生物多样性的分析方法，对该地区真菌菌群的基本特征、空间分布状况和物种多样性进行调查，为进一步揭示微生物和环境之间的关系奠定基础。

1材料与方法

1.1材料和试剂

土样采自宽阔水自然保护区。马丁氏培养基、马铃薯琼脂培养基、沙氏培养基均按标准方法配制，所用试剂为国产分析纯。真菌基因组DNA提取试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司。

1.2试验方法

1.2.1土样采集选取宽阔水自然保护区内的红沙地、花生地、太阳山、煤场湾、天鹅湖、珙桐沟和一线天7个区域，GPS记录采集地的地理位置，采集地环境描述（表1）。采用对角线型路线多点采集腐殖质层土壤样品于灭菌袋中，进行编号，4 ℃保存。

1.2.2土壤真菌的分离及纯化分离培养基为马丁氏琼脂培养基、改良沙氏孟加拉红培养基和马铃薯孟加拉红培养基，均在使用前加入链霉素，使培养基中含链霉素30 μg/mL。

用稀释涂布法分离土壤真菌。称取10 g土壤于90 mL含少量玻璃珠的无菌水中，充分振荡混匀，按10倍稀释法稀释到1×10-3，取400 μL菌悬液于培养基上，均匀涂布，28 ℃培养5 d，进行菌落计数。

1.2.3ITS序列分子鉴定

1.2.3.1真菌基因组DNA的提取基因组DNA提取按照试剂盒操作说明书进行。

1.2.3.2ITS序列的PCR扩增（1）引物序列如下：ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。（2）PCR反应体系：扩增反应体系为25 μL（表2）。配制完成后，充分混匀，稍加离心使体系在PCR管底部，再置于PCR仪上进行扩增。（3）PCR扩增条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，55 ℃ 引物退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。

1.2.3.3PCR扩增产物的检测反应结束后，分别取3 μL PCR产物和DNA marker点于1% 琼脂糖凝胶的点样孔中进行电泳，结束后使用凝胶成像系统进行观察，若条带单一且明亮清晰则表明扩增成功，样品可用于进一步测序。

1.2.4序列测定与分析方法

1.2.4.1测序PCR产物经纯化后用全自动DNA测序仪进行测序，获得ITS序列。

1.2.4.2序列及真菌种群分布分析将已测定的序列在表1土壤采集地环境描述

采集地纬度（N）经度（E）海拔（m）土壤类型土壤pH值生境类型红沙地28°13′10″107°9′17″1 486 ～ 1 510紫色土5.5灌木丛花生地28°13′26″107°9′43″1 503 ～ 1 517黄棕壤6.0竹林地太阳山28°14′9″107°9′37″1 592 ～ 1 722黄棕壤6.0方竹煤场湾28°13′56″107°9′42″1 555 ～ 1 579黄壤6.5灌木丛天鹅湖28°13′45″107°9′43″1 515 ～1 524黄壤7.0灌木丛珙桐沟28°13′59″107°10′1″1 582 ～ 1 629黄壤6.5灌木丛一线天28°14′11″107°11′12″1 411 ～ 1 455黄壤6.5灌木丛

表2PCR反应体系组分

反应组分体积（μL）引物ITS1 1引物ITS4 1模板 22×PCR Master Mix12dd H2O 9

GenBank上使用Blast（basic local alignment search tool，Blast 2.2.31）进行序列比对分析、鉴定。

1.2.5真菌多样性分析方法采用物种个体数量（N）、物种数（S）、种群优势度（d）、Margalef丰富度指数（R）、Shannon-Wiener的多样性指数（H′）、Pielou均匀度指数（J）和Jaccard相似性指数（Cj）对宽阔水保护区不同土壤真菌群落多样性进行分析[5-7]。

种群优势度：di=Ni/N；

Margalef丰富度指数：R =（S-1）/lnN。

Shannon-Wiener多样性指数：H′ =-∑PilnPi（i=1，2，3，…，n）；

Pielou均匀度指数：J =H′/lnS。

式中，Pi=di，表示第i种个体数占总个体数的比例。

Jaccard相似性指数：Cj = c/（a+b+c）。

式中，a和b分别为2种生境地中真菌的种数或属数，c为2种生境地中共有的真菌种数或属数。Jaccard相似性系数（Cj）用于比较2个生境中真菌种类组成的相似程度，根据其原理：当Cj为0.00～<0.25时，为极不相似；当Cj为0.25～<0.50时，为中等不相似；当Cj为0.50～<0.75时，为中等相似；当Cj为0.75 ～1.00时，为极相似。

2结果与分析

2.1总体土壤真菌的群落组成

2.2不同土壤真菌群落组成及优势度分析

2.3不同土壤真菌群落多样性差异

生境条件越适宜，丰富度指数和多样性指数越高，多样性指数也可反映出群落稳定性大小。均匀度反映的是群落中不同物种分布的均匀程度[9-10]。由表4可见，真菌单菌落数量S为黄壤>紫色土>黄棕壤，物种数（属数）N为紫色土>黄壤>黄棕壤，Margalef丰富度指数R黄壤>紫色土>黄棕壤，Shannon-Wiener多样性指数H′紫色土>黄壤>黄棕壤，Pielou均匀度指数J黄棕壤>黄壤>紫色土。紫色土和黄棕壤的Jaccard相似性指数Cj为0.536，中等相似；紫色土和黄壤Cj为0.500，中等相似，黄棕壤和黄壤Cj为0.444，中等不相似。

3讨论

本研究采用种群优势度、丰富度指数、多样性指数、均匀度和相似度指数，对宽阔水自然保护区3种不同土壤的真菌群落多样性进行了分析。结果表明，从群落组成来看，各类土壤的优势种属、常见种属和稀有种属均有较大差异，其中有一些属为其相应土壤所特有。宽阔水自然保护区土壤中大量存土壤类型S（N）RH′J紫色土26（127）5.160 82.775 60.851 9黄棕壤17（90）3.555 72.468 20.871 2黄壤22（136）4.274 72.676 10.865 8

在的酵母菌属（Saccharomyces）、木霉属（Trichoderma）、被孢霉属（Mortierella）、拟青霉属（Paecilomyces）、绿僵菌属（Metarhizium）、黏帚霉属（Gliocladium）等，具有较高的利用价值和应用前景，可作为农林病害防治和可持续开发的资源[11-15]。此外，不同土壤真菌群落多样性存在一定差异，Margalef丰富度指数最高的是黄壤真菌，最低的是黄棕壤；3种土壤真菌群落的Shannon-Wiener多样性指数在2.46～278之间，紫色土最高，黄棕壤最低；黄棕壤的Pielou均匀度指数最高，紫色土最低；Jaccard相似性指数为0.444 ～0536，表明3种土壤相似性介于中等相似和中等不相似之间。造成不同土壤真菌群落多样性的差异原因比较复杂，除了土壤质地和土壤肥力外，还与其对应生境地的光照、降雨量、植被类型等有关[16-17]。同时由于其中一些种属的菌株具有生防功能，且不同微生物群落之间产生的相互作用使网络结构发生改变，因此在一定程度上也影响了环境中的真菌多样性[18]。

由于传统培养方法的局限性，大量不可培养微生物无法通过分离获得，菌株数量十分有限。因此还需尝试多种不同的分离方法，结合以分子生物学为基础的相关技术进行多样性分析，才能更加全面地了解宽阔水保护区的土壤真菌多样性分布特征以及与环境之间的相互关系。

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