周红宇++杨德

摘要：利用水酶法，以油茶籽粕为原料，采用正交试验法优化了纤维素酶酶解提取茶皂素工艺，并对壳聚糖-蛋白酶联用纯化茶皂素进行了研究。结果表明，蛋白酶处理可显著降低提取液中蛋白质含量和壳聚糖絮凝时茶皂素损失率；各因素对油茶皂素提取率影响顺序为酶添加量>料液比>提取温度>提取时间，最佳提取工艺为酶添加量 6 mg/g，料液比1 g ∶25 mL，提取温度50 ℃，提取时间120 min。

关键词：水酶法；茶皂素；提取纯化

中图分类号：R284.2文献标志码：A文章编号：1002-1302（2016）05-0362-03

茶皂素别称茶皂苷，是存在于山茶科（茶、油茶、山茶）植物中的一类五环三萜皂苷类物质，是一种性能优良的天然非离子型表面活性剂，在工业、医药、农业等领域有广泛用途[1-2]。目前，提取茶皂素的方法主要有水浸提法、有机溶剂提取法、吸附法、超声波提取法、微波辅助提取法等，其中有机溶剂提取法应用广泛，但存在工艺复杂、条件要求高、能耗高、环境不友好等问题，限制了其产业化规模。因此寻找简单、经济、高效且适合工业化生产的茶皂素提取纯化方法非常必要。本研究以油茶籽粕为原料，以水代替有机试剂进行油茶皂素提取，探索酶解工艺、壳聚糖絮凝工艺在茶皂素提取上的应用，旨在为茶皂素工业化生产提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

油茶籽粕由湖北省广水市涂氏农业开发有限公司提供，70 ℃ 烘干后粉碎，过40目筛，置于干燥器中备用。15 000 μ/g纤维素酶（国药控股有限公司）、10 000 μ/g木瓜蛋白酶（上海沃凯生物技术有限公司）、茶皂素标准品（纯度98%、上海紫一试剂厂）；试剂均为分析纯。HW.SY21-K电热恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表公司）、FA1004B分析天平（上海越平科学仪器有限公司）、GL-25MS高速冷冻离心机（上海卢湘离心机仪器有限公司）、TU-1810型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.2试验设计

1.2.1单因素试验研究酶添加量、料液比、酶解温度、酶解时间等4个因子对茶皂素溶出率的影响。

1.2.1.1酶添加量对茶皂素溶出率的影响在料液比为 1 g ∶10 mL，酶解温度为 55 ℃，酶解时间2.5 h条件下，考察酶添加量对油茶皂素提取率的影响。

1.2.1.2料液比对茶皂素溶出率的影响在酶用量 4 mg/g，酶解温度55 ℃，酶解时间2.5 h条件下，考察料液比对油茶皂素提取率的影响。

1.2.1.3酶解温度对茶皂素溶出率的影响在酶用量 4 mg/g，料液比为1 g ∶20 mL，酶解时间2.5 h 条件下，考察酶解温度对油茶皂素提取率的影响。

1.2.1.4酶解时间对茶皂素溶出率的影响在酶用量 4 mg/g，料液比为1 g ∶20 mL，酶解温度为55 ℃条件下，考察酶解时间对油茶皂素提取率的影响。

1.2.2多因素正交试验通过以上单因素试验，得出每个单因素的最佳值，设定不同酶的添加量、提取时间、提取温度、料液比进行L9（34）正交试验。

1.3测定方法

1.3.1油茶籽粕成分分析测定油茶籽粕中水分、总糖、蛋白质、脂肪、粗纤维、茶皂素含量。

1.3.2茶皂素提取方法称取处理后的油茶籽粕50 g置于1 000 mL烧杯中，按试验设计的料液比加入蒸馏水、纤维素酶，设定提取温度与提取时间，提取完成后离心，取上清液备用。

茶皂素提取率=提取液中茶皂素浓度×提取液体积原料质量×100%；（1）

1.3.3蛋白酶酶解方法取提取液离心后得到的上清液500 mL，调节pH值为6.5，加入木瓜蛋白酶以除去提取液中的蛋白质，酶解条件为：酶添加量1%，酶解温度50 ℃，酶解时间2 h，计算酶解前后提取液中蛋白质含量和蛋白质去除率。

蛋白质去除率=酶解前提取液中蛋白质浓度-酶解后提取液中蛋白质浓度絮凝前提取液中茶皂素浓度×100%；（2）

1.3.4壳聚糖絮凝取蛋白酶酶解前后的提取液100 mL，考察1%壳聚糖溶液添加量及絮凝时间对皂素纯化效果影响。

茶皂素损失率=絮凝前提取液中茶皂素浓度-絮凝后提取液中茶皂素浓度絮凝前提取液中茶皂素浓度×100%；（3）

蛋白质去除率=絮凝前提取液中蛋白质浓度-絮凝后提取液中蛋白质浓度絮凝前提取液中茶皂素浓度×100%。（4）

1.3.5其他指标参照GB 5009.3—2010 《食品安全国家标准 食品中水分的测定》规定的方法测定水分含量；采用索式提取法测定脂肪含量；采用浓硫酸-香草醛法[3] 测定茶皂素含量。采用双缩脲法[4] 测定蛋白质含量。采用 GB/T 6434—2006 《饲料中粗纤维测定方法》规定的方法测定粗纤维含量。采用苯酚硫酸法测定总糖含量。

2结果与分析

2.1油茶籽粕主要成分

由表1可知，油茶籽粕总糖含量为31.07%，粗纤维含量17.69%，蛋白质含量13.60%，总糖、蛋白质含量较高会对茶皂素提取、纯化产生影响。粗纤维主要由细胞壁成分组成，其存在会影响皂素溶出，因此，通过添加纤维素酶使粗纤维酶解从而促进茶皂素溶出。

表1油茶籽粕主要成分含量

指标含量（%）水分8.32总糖31.07蛋白质13.60脂肪6.50粗纤维17.69茶皂素13.09

2.2单因素试验结果

2.2.1酶添加量对油茶皂素提取率的影响不同酶的添加量对油茶皂素提取率的影响如图1所示，油茶皂素提取率随纤维素酶添加量的增加先升高后降低，酶添加量为4 mg/g时提取率最高，达到12.79%。纤维素酶可破坏植物的细胞壁，从而促使茶皂素等成分溶出；另一方面，茶皂素具有亲脂性，酶添加量增加时茶皂素提取率降低可能和脂肪浸出率增加有关。

2.2.2料液比油茶皂素提取率的影响从图2可以看出，随着料液比的增加，茶皂素提取率随之增加，考虑到后续浓缩成本，选择1 g ∶20 mL作为最佳料液比。

2.2.3提取温度对油茶皂素提取率的影响由图3可知，随着提取温度的增加，茶皂素提取率先升高后降低，提取温度达到55 ℃时，提取率最高，因此茶皂素提取工艺的提取温度确定为55 ℃。在一定范围内，温度升高时酶活性增大，水活度增加也更有利于成分溶出；温度达到一定高度会抑制酶活性，导致提取率降低。

2.2.4提取时间对油茶皂素提取率的影响由图4可知，茶皂素提取率与提取时间呈正相关，即提取时间越长油茶皂素提取率越高，但90 min后油茶皂素提取率增加趋势趋缓，提取时间延长会增加能耗，因此选择120 min作为正交试验提取温度。

2.3正交试验结果

在单因素试验基础上，对选定的酶添加量、料液比、提取时间、提取温度等4 个因素进行L9（34）正交试验，考察酶添加量、料液比、提取时间、提取温度的综合作用。试验因素水平见表2，试验结果见表3。从表2、表3可看出，各因素对油茶皂素提取率影响由大到小为A>B>C>D，试验最优条件为A3B3C1D2，即酶添加量6 mg/g，料液比1 g ∶25 mL，提取温度50 ℃，提取时间120 min。

2.4壳聚糖絮凝纯化茶皂素工艺

壳聚糖在烯酸溶液中分子链中带有大量的正电荷，是天然絮凝剂，可以对蛋白质、核酸、多糖等大分子絮凝回收。由图5、图6、图7可知，酶解前，随着壳聚糖添加量增大，茶皂素损失率增加，添加3 mL 1%壳聚糖溶液时茶皂素提取率为957%，蛋白质含量下降至140 μg/mL，茶皂素损失率在25%左右；酶解后壳聚糖絮凝时茶皂素损失率显著降低，添加 3 mL 1%壳聚糖时蛋白酶对蛋白质酶解效率较高，酶解后提取液中蛋白含量下降至63 μg/mL左右，茶皂素损失率约为10%，相比酶解前蛋白含量下降更显著，同时茶皂素损失率较

低。絮凝时间延长，茶皂素损失率增大，同时蛋白质等杂质的去除率也增大，由试验可知，添加3 mL壳聚糖溶液，絮凝4 h即可取得较好的效果。

3结论

纤维素酶是酶的一种，在分解纤维素时起生物催化作用，可以将纤维素分解成寡糖或单糖，在食品行业和环境行业均有广泛应用[5-9]。提取茶皂素时，纤维素酶的加入可增大茶皂素分子向溶剂溶出的通道，从而提高茶皂素提取率。本研究结果表明，纤维素酶的加入可提高茶皂素水提取的得率，最佳提取工艺为酶添加量6 mg/g，料液比1 g ∶25 mL，提取温度50 ℃，提取时间120 min。壳聚糖的加入可有效去除提取体系中的蛋白质等杂质，在未经蛋白酶酶解的提取体系中，壳聚糖絮凝蛋白质等大分子易导致茶皂素损失率较大，这可能与茶皂素与糖类大分子、蛋白质的结合有关[10]。蛋白酶酶解后，添加壳聚糖絮凝时茶皂素损失率下降，表明蛋白酶处理可作为壳聚糖絮凝除杂前的必要步骤。

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