田慧敏++文静++任芳

摘要：利用子实体形态特征和rDNA-ITS测序分析相结合的方法，对采自内蒙古赤峰市赛罕乌拉自然保护区的1份色钉菇[Chroogomphus rutilus （Schaeff.） O.K. Mill]进行了鉴定，对其rDNA-ITS区段进行扩增，片段约为730 bp，并对其外形特征及显微特征进行了详细描述。

关键词：色钉菇；ITS测序；形态学；菌种鉴定

中图分类号： S646.901文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0261-03

色钉菇[Chroogomphus rutilus （Schaeff.） O.K. Mill.]，别称血红铆钉菇，俗称红蘑、松蘑等，属担子菌门牛肝菌目（Boletales）铆钉菇科（Gomphidiaceae）色钉菇属（Chroogomphus），首次由Jacob 于1774年描述为Agaricus rutilus，后Miller于1964年划入色钉菇属Chroogomphus[1]。该菌与松属的植物共生，最早发现于欧洲和北美，主要识别特点是菌盖近圆锥形，后平展中部凸起，边缘内卷，浅棠梨色至咖啡褐色、砖红色、红褐色，湿时黏，干有光泽。菌褶延生，稀，青黄色渐变紫褐色，不等长，菌柄与菌盖色相近且基部带黄色，上部有易消失的红褐色菌环，囊状体呈长棒状[2]。

研究表明，色钉菇含有多种氨基酸、蛋白质、维生素、多糖、萜类、内酯、香豆素、酚类、甾类等营养物质，具有广泛的药用活性[3]，其多糖具有明显的抗肿瘤活性，尤其对肝癌的治疗具有辅助作用[4-7]，在我国该菌广泛分布，是名贵的野生食用真菌和药用菌，深受人们的喜爱，但是其子实体受环境和地域的影响，颜色、大小会有一定的变化，而且该种与多种铆钉菇科真菌外形相似，如粘铆钉菇（Gomphidius glutinosus）、红铆钉菇（G. roseus）、亚红铆钉菇（G. subroseus）等，采食时容易混淆，市场上的干品经常会混有其他品种，因此仅靠形态识别会产生误差。国内外许多菌物学家利用ITS测序技术对其进行了鉴定并研究了演化地位[8-10]。本研究利用形态学和 rDNA-ITS 序列测序法相结合的方法对色钉菇（Chroogomphus rutilus）进行了分类鉴定并做了详细的描述。

1材料与方法

1.1供试标本

供试标本子实体于2013年8月17日采自内蒙古赤峰市赛罕乌拉自然保护区庆云山（43°12′ ～44°28′N，118°11′ ～120°05′E），樟子松地上散生。标本晾干后，编号（CFSZ10397、10390）、分类、鉴定，超低温冷冻后存放于赤峰学院菌物标本室（CFSZ）。

1.2形态鉴定

宏观观察使用体视显微镜，颜色的判断主要依据采集时拍摄的彩色照片，大小用游标卡尺测量新鲜子实体2～5个，菌盖、菌柄大小、颜色、形状、附属物等，菌褶颜色，变化，着生方式，菌肉颜色、味道、气味等项。显微观察通常4%～5%KOH作浮载剂。孢子、菌丝、囊状体、担子等的淀粉质反应是将材料置于Melzer氏试剂中来判断。

1.3ITS鉴定

1.3.1基因组DNA的提取及检测子实体干品菌盖部分（含菌褶）用液氮研磨，使用北京鼎国生物公司的真菌DNA提取试剂盒对提取的DNA进行纯化后，先用0.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.2rDNA-ITS区PCR扩增ITS-PCR的扩增体系为：PCR mix 25 μL，20 mol/L ITS1/ITS4引物各0.5 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 22 μL，反应总体积为50 μL。扩增反应在德国eppendorf公司的5331型PCR扩增仪上进行。扩增程序为：94 ℃ 3 min；95 ℃ 40 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共34个循环；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。ITS引物为ITS1和ITS4通用引物[11]。

1.3.3测序PCR产物经Takara胶回收试剂盒回收纯化后，委托上海生工生物科技有限公司完成。

1.3.4ITS序列比较和系统发育分析将已测得的ITS序列和从GenBank上获得的相似度90%以上的铆钉菇属和粘铆钉菇属18个ITS序列，用MEGA 6.06软件进行多重对位排比，并采用最大相似法（ML）构建系统发育树，系统树的每个分支的统计学显著性分析以Bootstrap方法进行检验，重复次数为1 000次。

2结果与分析

2.1形态学鉴定结果

根据样品10397子实体菌盖的颜色、形状、大小以及孢子、担子、囊状体等显微形态特征初步鉴定为色钉菇[Chroogomphus rutilus （Schaeff.） O.K. Mill.]。

子实体中等大小，菌盖直径2.5～9.0 cm，初期钟形或近圆锥形，后平展中部凸起，边缘内卷，有时平展，紫红色、葡萄酒红色、砖红色，表面很黏，光滑，表皮下淡紫红色；菌肉白色带红色，干后淡紫红色，近菌柄基部带黄色，无明显气味，菌褶延生，稀，幼时青黄色、锈色，后渐变为紫褐色、灰紫色或灰褐色，每2长菌褶间有1片不等长的短菌褶，小菌褶至菌盖边缘长出。菌柄长3～7.5 cm，粗1.0～2.5 cm，圆柱形且向下渐细，上部有黏液，色同菌盖，近基部黄色，表面不光滑，似有纤维状绒毛。实心，上部往往有紫褐色纤毛状菌环。孢子印橄榄色至黑褐色。

孢子大小为（12.2～20.6）μm×（4.5～7.2）μm，长椭圆形或梭形，淡棕色或黄棕色，中间有青黄色内含物，有小尖，有的具2～3个小油滴，淀粉质。担子大小为（50～70）μm×（8～10.2）μm，棒状，顶端渐膨大，无色，4个小梗。褶侧囊体大小为（110.6～187.2）μm×（13.2～18.8）μm，无色，圆柱状或棒状，基部渐细，薄壁。菌褶菌丝短柱状，无色直立，有隔膜，大小为（43.2～76.8）μm×（10.8～19.2）μm，未见锁状联合，Melzers试剂变蓝。菌盖表皮由排列紧密的菌丝组成，菌丝圆柱状，直立，顶端稍膨大，无色，薄壁，有隔膜，大小约（50～110.4）μm×（6.0～9.6）μm，菌柄表皮由杂乱的菌丝组成，菌丝圆柱状，无色，直径7.2～14.4 μm（图1）。

色钉菇（C .rutilu）与黏铆钉菇（Gomphidius glutinosus）、红铆钉菇（G.roseus）、亚红铆钉菇（G.subroseus）均生长于我国华北地区，外形相似，但是G. glutinosus为灰紫色，暗褐色，具黑色斑点，C .rutilus菌盖偏红色，与红铆钉菇（G. roseus）、亚红铆钉菇（G. subroseus）相比，C. rutilus菌盖偏紫色，有时具有黄色色调，而G. roseus和G. subroseus常常是粉红色或正红色[12-13]，而且菌盖边缘往往有菌幕残留，4种真菌都常见于松林中，在我国华北地区均有分布，可作为食用菌，但采集食用前去除黏液和菌盖表皮为宜[14]。

2.2PCR扩增及ITS序列比对结果

对供试样品基因组DNA的18S rRNA、ITS1、5.8S rRNA和 ITS2进行扩增，结果显示ITS序列长约730 bp。将该菌ITS序列与NCBI的GenBank数据库进行Blast检索比对，共得到了18个与供试样品具有较高相似率的序列物种（表1）。

2.3系统发育分析

对ITS序列系统发育树分析结果表明，19个种聚为4大类，即美味牛肝菌（Boletus edulis）、Rhizopogon salebrosus、铆钉菇属（Gomphidius）和铆拟钉菇属（Chroogomphus），铆钉菇属（Gomphidius）和铆拟钉菇属（Chroogomphus）分别处于不同的分枝，样品10 397与C. rutilus聚为一类，处铆拟钉菇属（Chroogomphus）分枝上，支持率为95%（图2）。与C. orientirutilus亲缘关系较近，而与Gomphidius glutinosus、G. roseus、G. subroseus亲缘关系较远。

3讨论

ITS测序及系统发育树分析表明，色钉菇（C. rutilus）与东方色钉菇（C. orientirutilus）、紫色钉菇（C. purpurascens）、变色色钉菇（C. vinicolor）和易混色钉菇（C. confusus）亲缘关系较近，而与Gomphidius glutinosus、G. roseus、G. subroseus亲缘关系较远。但是C. orientirutilus菌盖亮红色、血红色，且囊状体具有块状结晶[15]，而C. rutilus菌盖紫红、咖啡红色，囊状体壁光滑；C. purpurascens菌盖紫色或深紫色，菌柄橘黄色，而C. rutilus菌盖偏红色，具有紫色色调，菌柄色同菌盖，仅基部亮黄色；变色色钉菇（C. vinicolor）菌盖表面不黏，有时具细

小绒毛，且囊状体壁厚，最宽处可达5～7.5 μm[2，16-17]，而C. rutilus菌盖湿时很黏，光滑，囊状体壁很薄；易混色钉菇（C. confusus）菌盖较小，为1～4cm，黄棕色、橘色具有红色色调，且囊状体具，结晶。而且东方色钉菇（C. orientirutilus）、变色色钉菇（C. vinicolor）、易混色钉菇（C. confusus）生长于在我国西南部，只有紫色钉菇（C. purpurascens）生于我国东北部，色钉菇（C. rutilus）全国都有分布。铆钉菇属（Gomphidius）和色钉菇属（Chroogomphus）同属于铆钉菇科（Gomphidiaceae），亲缘关系较近，外形特征极其相似，很难区分，二者主要的区别是钉菇属（Chroogomphus）菌肉往往黄色或橙色，菌丝组织在Melzers试剂中变蓝，而铆钉菇属（Gomphidius）主要的区别特征是菌褶幼时有菌幕，菌盖边缘往往有菌幕残留物，有时会脱落，组织非淀粉质[1，2，10]，有时这些特征不太明显，给鉴定带来一定困难。ITS以其简便易操作、变异度丰富等特点，在真菌种及相似种的鉴定中起着很重要的作用，但由于该区片段有限，携带信息较少，在鉴定过程中存在一定的误区，将二者相结合，可使鉴定更加准确、全面。

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