陈丽丽++何玲玲++赵雅

摘要：研究了地衣芽孢杆菌W10对烟草的促生作用及对生长相关基因表达的影响，结果表明：W10能明显增加烟草根长、株高、鲜质量；与对照相比，W10处理烟草后茉莉酸信号通路标志基因COI1和调节植物细胞生长的扩展基因NtEXP2、NtEXP6都不同程度上调表达。

关键词：地衣芽孢杆菌；烟草；促生作用；促生机制

中图分类号：S476.1；S572.04文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0152-03

芽孢杆菌（Bacillus spp.）是植物病害生物防治研究和应用较多的一类生物防治细菌，其生物防治机制主要有营养和空间位点竞争、产生多种抑菌物质（如脂肽类抗生素、降解胞壁酶类、细菌素、抗菌蛋白、多肽类化合物等）、溶菌作用、促进植物生长、诱导植物抗病性等方面[1-2]。地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）W10是笔者从根际筛选获得的1株生物防治细菌，对多种植物病原真菌均有较好的抑制作用，田间防治效果与化学药剂相当，已明确该菌株的防病机理涉及竞争定殖作用、产生抗菌蛋白和诱导植物产生抗病性[3-9]。但该菌株的促生作用尚不清楚。本研究对地衣芽孢杆菌W10在烟草上的促生作用及分子机制进行了初步研究，旨在为拓宽生物防治细菌地衣芽孢杆菌W10的应用领域奠定基础。

1材料与方法

1.1供试烟草和菌株

供试烟草品种三生烟（Nicotiana tabacum L. “Xanthi”）种子由笔者所在实验室提供；生物防治细菌地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）W10从番茄根际土壤中分离获得。

1.2培养基

细菌培养基NB：5 g聚蛋白胨、3 g牛肉浸膏、1 g酵母膏、10 g蔗糖、1 L水，pH值7.0，用于W10菌株种子活化和摇瓶培养。水琼脂培养基：15 g琼脂、1 L水，用于烟草种子培养。1/2 MS培养基：4.42 g MS、30 g蔗糖、2 g植物凝胶、1 L水，pH值5.8，用于烟草培养。

1.3W10菌液制备

将活化的W10接种于150 mL NB中，28 ℃、180 r/min条件下培养2 d得到培养菌液，用平板计数法测量浓度，调制成1亿 CFU/mL，作为烟草处理菌液。

1.4烟草根长的测量

将三生烟种子在W10菌液中浸泡6 h，然后用15%次氯酸钠溶液表面消毒10 min，无菌水漂洗3次后，呈直线均匀排列在水琼脂培养基平板上，竖置于26 ℃光照培养箱中培养（16 h/d光照）。根据平板摆放位置距离光源远近，设3个处理，分别为：处理1，距离光源近；处理2，距离光源中等；处理3，距离光源远。每个处理重复3次（平板），每个平板10粒烟草种子，同时设清水对照（CK）。待处理的烟草种子根长至25 mm左右时，测量各处理根长。

1.5烟草株高和鲜质量的测量

将三生烟种子于15%次氯酸钠溶液中消毒10 min，用无菌水漂洗3次后，均匀放入1/2MS平板中，并置于26 ℃光照培养箱中培养（光照时间16 h/d），出芽后幼苗长至高1～2 cm 时将其轻轻从培养基中连根拔出，用W10菌液处理 6 h，后移入含灭菌营养土的盆钵中，置于温室培养，设清水对照。距光源远近设3个处理，每个处理重复3次，每个重复6株烟草。待烟草幼苗三叶一心时测量株高。

上述烟草幼苗长至五叶一心时，用W10菌液浇灌烟草根部，每株10 mL，10 d后测量整株烟草的鲜质量。

1.6基因表达分析

1.6.1烟草总RNA提取和检测W10菌液灌根处理2 d后，取烟草上部嫩叶，采用AxyPrep总RNA提取试剂盒[美国Axygen生物技术（杭州）有限公司]提取烟草叶片总RNA。用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，分光光度计检测RNA的纯度，质量符合要求后计算RNA样品的浓度（D260 nm×稀释倍数×40），RNA样品于-20 ℃保存备用。

1.6.2半定量RT-PCR分析取2 μg RNA作为模板，以Oligo（dT）15为引物，用反转录酶M-mLV（RNase H—）（Promega公司）合成cDNA。取适量反转录产物为模板，进行PCR反应。以在真核生物中高度保守并且组成性表达的EF-1α基因为内参。拟PCR扩增的基因有抗病防卫反应调控基因NPR1[10]，茉莉酸（jasmonic acid，JA）信号通路分子标志基因Thi2.1、COI1，调节植物细胞生长的扩展基因NtEXP2、NtEXP6[11]。基因名称、登录号、上游引物/下游引物、涵盖长度、PCR反应条件等信息见表1。

采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

2结果与分析

2.1地衣芽孢杆菌W10对烟草根长的影响

从图1可见，地衣芽孢杆菌W10对烟草根生长具有明显的促进作用，其中距离光源近的处理促生作用最明显，比对照根长增加了105.6%，距离光源较远的处理也比对照增长36.0%。

2.2地衣芽孢杆菌W10对烟草株高的影响

由图2可见，经地衣芽孢杆菌W10处理后，烟草株高比对照增加了41.2%～76.5%，距离光源越近，烟草株高不断增加，但促生作用在减少。如近光源处理烟草株高达到了 12 cm，但促生作用只有41.2%；远光源处理株高虽然只有 10 cm，但促生作用达到了76.5%。

2.3地衣芽孢杆菌W10对烟草鲜质量的影响

由图3可知，地衣芽孢杆菌W10处理后，烟草鲜质量明显增加，比对照增加101.9%～114.6%，且各光源距离处理间差异不明显，这可能与烟草五叶一心期进行了1次W10菌液灌根有关，W10菌液灌根促进烟草生长，减小了不同光源距离处理间的差异。

2.4烟草中促生相关基因的表达

从图4可以看出，地衣芽孢杆菌W10菌液处理烟草后，JA信号通路标志基因COI1以及调节植物细胞生长的扩展基因NtEXP2、NtEXP6都能不同程度地被诱导表达，其中COI1、NtEXP2呈组成性本底表达（对照），W10菌液诱导后表达量略有上升。W10菌液处理的烟草中NtEXP6基因表达微弱，但对照检测不到该基因的表达。多次PCR分析并未发现抗病防卫反应调控基因NPR1、JA信号通路标志基因Thi2.1的表达。

3结论与讨论

目前芽孢杆菌对植物促生作用的报道集中在枯草芽孢杆菌（B. subtilis）[12-15]、解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）[16-18]、蜡状芽孢杆菌（B. cereus）[19-20]、巨大芽孢杆菌（B. megaterium）[21-22]，涉及蔬菜、果树、小麦、烟草等植物。

而地衣芽孢杆菌的促生作用及机制研究未见报道。本研究发现，地衣芽孢杆菌W10对烟草根长、株高、鲜质量都有明显的促生作用，同时也发现距离光源距离对烟草生长也有一定影响，一般距离光源近的处理生长量较大，这可能是由于近光源位置光照度和温度都较高，有利于烟草植株的发育和生长，与光、温度等环境因子影响植物内源茉莉酸信号的变化[23]有关。本研究中有关根长、株高试验中，只进行了1次W10菌液处理，诱导强度较小，对烟草的促生作用小，从而导致个别处理和对照间差异不显著；而鲜质量试验进行了2次诱导处理，诱导强度较大，对烟草的促生作用也大，所有诱导处理和对照间差异均达到显著水平。因此，地衣芽孢杆菌W10须要多次诱导处理才会具有较好的植物促生作用。

JA和水杨酸（salicylate，SA）信号转导途径之间主要模式是拮抗作用，NPR1是SA信号途径中抗病防卫反应的正调控基因，在许多病原菌防卫基因的调控中起重要作用，它通过SA信号转导途径来抑制JA信号转导，是JA信号途径的负调控基因[24]，本研究中W10处理烟草后未能检测到NPR1基因的表达与此相吻合，说明W10引发的促生作用涉及JA信号途径。JA信号通路调节植物生长发育和对胁迫的响应[25]，COI1基因是JA信号途径中1个关键调控基因，目前为止是所有依赖JA信号响应所必需的[26]。本研究发现，COI1经W10诱导处理后表达有所增加，说明促生作用与JA信号通路有关。Thi2.1基因常被作为检测JA信号通路应答的标记基因[27]，但本研究未能检测到该基因的表达，这可能与该基因的表达水平低以及W10菌液诱导强度不够有关，也可能是该基因表达与抗性需要病原生物胁迫，还须进一步研究。

调节植物细胞生长的扩展基因NtEXP2、NtEXP6在枯草芽孢杆菌G1处理烟草1～3 d后能被诱导显著表达，且NtEXP2基因呈组成性表达[11]，这与本研究结果基本一致，但本研究中这2个基因诱导表达较弱，可能是地衣芽孢杆菌W10诱导处理次数较少的缘故，或许W10诱导的促生作用还可能由其他生长相关基因控制，这还须进一步研究。JA信号通路标志基因COI1、调节植物细胞生长的扩展基因NtEXP2、NtEXP6都不同程度地被地衣芽孢杆菌W10诱导表达，为地衣芽孢杆菌W10的促生作用提供了理论依据，也拓宽了这类生物防治菌的应用领域。

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