李婧++曾媛++龚胜

摘要：融合引物与巢式聚合酶链式反应（fusion primer and nested integrated PCR，FPNI-PCR）是一种分离并扩增已知序列旁未知序列的有效方法。以大花三色堇（Viola×wittrockiana Gams.）为材料，为提高FPNI-PCR产物特异性，增加条带清晰度，降低非特异性条带的干扰，对FPNI-PCR反应体系中第1轮的模板DNA浓度进行对比，优化了第3轮反应中引物浓度、Taq DNA 聚合酶浓度、缓冲液用量，筛选了第3轮特异性引物的退火温度，进一步完善了FPNI-PCR反应体系。各因素优化比对试验表明：FPNI-PCR第1轮反应体系应以稀释后的DNA为模板，20 μL体系中，用量在4.5～10 ng。第3轮最优反应体系为：20 μL反应体系中，特异性引物浓度0.2 μmol/L，引物SP2浓度 0.75 μmol/L，Taq DNA酶用量1.0 U，dNTP用量2 μL，10×buffer（20 mmol/L，Mg2+ plus）用量2 μL，模板1 μL（第2轮反应稀释100倍后取1 μL为模板），ddH2O补足。第3轮反应中，退火温度为64 ℃或66 ℃时条带最为清晰。

关键词：大花三色堇；FPNI-PCR；体系优化

中图分类号： Q785文献标志码： A[HK]

融合引物与巢式聚合酶链式反应（fusion primer and nested integrated PCR，FPNI-PCR）是一种基于热不对称交错PCR （thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR）技术原理的PCR方法[1]，主要是利用目标序列旁的已知序列设计3 个嵌套特异性引物，与给出的9个特殊设计的随机简并引物（arbitrary degenerate prime，AD）相结合，进行1次巢式反应，并在简并引物的基础上设计2个嵌套的特殊引物替换第1轮PCR所用随机引物用于第2、3轮的扩增。FPNI-PCR中融合引物（fusion primer），即特殊设计的随机简并引物，由3′端的随机寡核苷酸（arbitrary degenerate oligonucleotides）和5′端可设计特异引物的一段序列组成，该序列用以替换初次PCR所用简并引物。经过热不对称循环后的产物含有特异引物结合位点，能有效降低产物稀释后非特异性扩增的影响[2]。FPNI-PCR具有高效灵敏、产物特异性高、重复性好、能够在较短的时间内获得目标片段等优点，是扩增基因侧翼序列特别是启动子的有效方法[3]。

FPNI-PCR与TAIL-PCR技术类似，其反应产物的稳定性、可重复性明显受到反应体系模板、引物、Taq DNA 聚合酶、Buffer以及3轮退火温度等因素的影响[4]。在进行 FPNI-PCR 反应获取未知序列时，有必要根据上述因素，对不同因素进行优化组合，以获得最优的反应结果。

大花三色堇（Viola×wittrockiana Gams.）是重要的冬春季花卉，有着十分丰富的花色和花斑类型，是研究植物花斑形成的理想植物[5]。笔者所在实验室先前的研究表明，二氢黄酮醇还原酶（dihydroflavonol reductase，DFR）和花青素合成酶 （anthocyanidin synthase，ANS）基因是三色堇花斑由无色转向着色的关键性基因[6]。关于DFR和ANS的相关研究发现，其启动子中含有的众多调控元件，与花色素调控密切相关[7-9]。因而这2个基因的启动子结构特点，可能是花斑位置形成的一个关键性因素，其启动子的克隆，对于进一步研究三色堇色斑的形成具有十分重要的意义。FPNI-PCR技术是克隆启动子序列的有效方法，而目前关于三色堇FPNI-PCR技术研究尚无相关报道，本研究以三色堇为材料，对其FPNI-PCR反应体系进行优化，为三色堇VwDFR和VwANS基因启动子的克隆提供技术基础。

1材料与方法

1.1材料与试剂

大花三色堇品种“宾哥”，花色为黄底黑斑，栽培于海南大学园艺园林学院基地。

1.2方法

1.2.1模板DNA的提取

提取三色堇幼叶DNA，步骤参考尚啸等的改良CTAB法[10]，仅核酸分离时改用加1/10体积的5 mol/L NaAc。提取的DNA用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，电泳结果通过凝胶成像仪（Dolophin- Doc，美国）拍照，利用紫外分光光度计测浓度。小管分装-20 ℃保存。

1.2.2试验中用到的引物包括FPNI-PCR反应体系中的第1轮、第2轮、第3轮的简并引物、特殊引物（表1）[1]以及根据VwANS基因设计的特异引物（表2）。

1.2.3FPNI-PCR体系的优化（1）模板DNA浓度筛选。将提取的DNA稀释100、200倍，然后将未稀释的DNA和稀释不同倍数的DNA作为第1轮PCR反应的模板，反应采用表1中的FP5、FP6、FP7、FP9这4条简并引物，反应程序见表3，反应体系为20 μL，具体组分见参考文献。

（2）FPNI-PCR反应退火温度的梯度筛选。根据设计的特异性引物GSP3的TM值，对第3轮退火温度进行梯度筛选，筛选温度分别是62、64、66 ℃。

（3）引物、10×buffer（20 mmol/L，Mg2+ plus）、Taq DNA酶用量的对比。 PCR反应采用20 μL反应体系，分别对影响第3轮反应体系中的主要参数：引物、10×buffer（Mg2+ plus）、Taq DNA酶，设置不同的浓度梯度，具体参数值见表3。此外，每20 μL反应体系中均含有dNTP（2.5 mmol/L）2 μL、特异性引物0.2 μmol/L，模板为第2轮反应产物稀释100倍取1 μL，加ddH2O补足至20 μL。逐一优化每个参数值，优化时，其他参数值均采用表3所列反应参数的第一水平值，引物采用参考文献中的FP5、FP6、FP7、FP9这4条简并引物 （表1），反应程序见表4。

2结果与分析

2.1DNA的提取结果

以三色堇嫩叶为材料提取DNA，经紫外分光光度计检测，浓度为（0.901±0.019）μg/L，D260 nm/D280 nm介于1.8～2.0之间，说明样品DNA中杂质较少。0.8%琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，点样孔无滞留，条带清晰明亮，无明显拖尾现象，说明RNA等杂质去除较干净。结果表明，采用改良CTAB法可以有效地提取三色堇幼叶的DNA[10]，对于后续PCR反应有利。

2.2DNA的浓度对FPNI-PCR的影响

模板DNA的用量对FPNI-PCR反应有着非常直观的影响，过多或者过少都会造成产物的不稳定或者无法产生条带。普通方法提取的DNA通常含有杂质，而杂质对PCR产物的影响是非常显著的。为了获得清晰条带，降低非特异性扩增，本试验以3个浓度的DNA为模板，利用FP5、FP7、FP9这3种简并引物分别扩增，其他条件相同，结果如图2所示。

以未稀释DNA为模板，3轮扩增后均无清晰条带（图2）。将DNA模板分别稀释100、200倍，随着DNA稀释倍数的增加，简并引物FP5扩增出的条带数量明显增加，且条带清晰度明显提升；简并引物FP9扩增的结果，100倍稀释比200倍稀释扩增条带数量更多、条带更加清晰（图2）。同时，7号引物在多个模板浓度下皆无明显条带，说明利用FPNI-PCR进行扩增时，模板的稀释倍数应配合不同的简并引物进行筛选，以期降低杂质等对反应的影响，才能获得更为清晰的条带。

2.3退火温度对扩增产物的影响

通过对5、7、9号引物扩增反应的第3轮扩增的退火温度进行筛选，筛选温度为62、64、66、68 ℃，结果见图3。总体来看，64、66 ℃反应效果更好，但是不同引物反应的最佳退火温度不同，如FP5引物64 ℃下扩增效果较好，FP9号中超过700 bp 的条带，在66 ℃下更清晰。

2.4Taq酶的用量对FPNI-PCR的影响

Taq酶在PCR反应体系中用量少，却极为重要，Taq酶的类型、用量，甚至是生产商，都会对PCR产物造成明显的影响。在本研究中，分别对以FP6和FP7简并引物扩增获得的PCR产物进行Taq酶的优化，其他条件全部相同，结果如图4所示。试验发现，Taq酶的用量对反应条带的数量和清晰度都有一定影响，随着Taq酶用量的增加，FP6和FP7扩增的PCR产物的量均有所提高，但FP6更为明显，能获得较为清晰的条带，而FP7无明显的清晰条带。以简并引物FP6扩增，Taq酶用量1.5 U时比1.0 U时条带亮度只略有提升，且非特异性扩增也更为明显，表明Taq酶用量1.0 U更为合适。

2.510×Taq buffer（Mg2+ plus）用量对FPNI-PCR的影响

分别以简并引物FP6和FP7进行扩增，通过改变10×Taq buffer（Mg2+ plus）用量，其他条件均相同，结果见图5。结果显示，以简并引物FP6扩增，3种缓冲液用量均获得条带，但用量为2 μL时，目的条带更为清晰；以简并引物FP7扩增，缓冲液为1.5 μL时无条带，由1.75 μL增至2 μL时，条带数量增加，清晰度略有增加。

2.6引物浓度对FPNI-PCR的影响

以FP6和FP7这2种简并引物扩增，对第3轮引物SP2浓度进行筛选。结果（图6）显示，引物浓度为0.25 μmol/L时，均无条带，随着引物浓度的上升，条带数量、亮度明显增加，非特异性扩增同样增加，条带出现模糊现象。由图6可知，以FP6和FP7为简并引物扩增，第3轮引物SP2浓度为0.75～1.0 μmol/L时，均有较好结果。但从节约成本、提高条带清晰度、减少非特异性扩增角度考虑，0.75 μmol/L时更佳。

3结论与讨论

3.1结论

从试验结果来看，FPNI-PCR适合以低浓度DNA为模板，第1轮反应以稀释后的DNA为模板，20 μL体系中，用量在4.5～10 ng。对三色堇FPNI-PCR第3轮体系进行优化，最优反应体系是：20 μL反应体系中，特异性引物浓度 0.2 μmol/L，引物SP2浓度0.75 μmol/L，Taq DNA酶用量10 U，dNTP用量2 μL，10×buffer（20 mmol/L，Mg2+ plus）用量2 μL，模板为第2轮反应稀释100倍后取1 μL，ddH2O补足。第3轮反应经温度筛选，退火温度64 ℃或66 ℃时条带最佳。

3.2讨论

FPNI-PCR是基于热不对称PCR技术原理的PCR方法，共包括3轮PCR反应。其中，第1轮反应中，含3次高严谨反应，目的是使高退火温度的特异性引物SP1与模板序列退火延伸；1次低严谨反应，目的是使简并引物结合到较多的目的序列上；5次热不对称的高低特异性循环交替反应，使目的片段得以指数性扩增。第2、3轮为普通PCR反应，通过特异性嵌套引物进一步扩增目的条带。它与普通TAIL-PCR的主要区别在于给出了经过优化后的一系列简并引物，并在简并引物的基础上设计了嵌套的特殊引物FSP1、FSP2用于第2、3轮的扩增[2]。特异性嵌套引物的存在，使非目的条带得不到大量扩增，而非目标序列中的发卡结构也能抑制其扩增，从而提高了目的片段扩增的准确性[11]。

由于FPNI-PCR反应步骤较多，因此影响扩增结果的因素也较多。首先，第1轮的高低严谨热不对称反应是目标片段扩增的最初环节，而本试验证明，模板浓度是影响第1轮反应结果的关键因素。在研究中发现，低浓度的DNA模板更容易获得扩增结果，且模板DNA的稀释倍数对不同简并引物扩增的影响不同。在其他PCR反应的研究中同样发现，植物DNA模板的浓度对于目的片段的扩增具有很大的影响[12]。在TAIL-PCR中，通常需要对模板进行稀释，才能获得较为清晰的条带[4，13]。原因可能是DNA中所含杂质的影响，未稀释的高浓度DNA中所含杂质更多，影响条带扩增，另外，不同简并引物对模板的浓度要求也可能不同，所适应的模板浓度存在差异。

在FPNI-PCR反应中，第1轮扩增产物因条带杂、浓度低，往往无法通过凝胶成像显示，需要通过第2轮对目标条带的进一步扩增获得初步结果。通过第2轮产物凝胶成像，以有条带的第2轮稀释产物为模板，通过第3轮反应进一步扩增，以期获得较第2轮更为清晰的条带。因此，第3轮反应体系的优化对最终结果的获得具有重要作用。

本研究中，针对第3轮PCR反应中部分因素进行了优化，结果发现，与buffer（Mg2+ plus）、Taq DNA酶用量相比，引物的浓度影响最为显著，随着引物浓度的上升，条带数量、亮度明显增加。需要注意的是，较高的引物浓度虽有利于扩增，但会造成条带模糊、非特异性条带增加，这与其他PCR反应类似[14]，不利于与第2轮条带比对推测目的条带。虽然 FPNI-PCR中融合引物特殊且相对较短，有利于与DNA模板结合扩增目的条带，但经过3轮反应虽然在一定程度上降低了非特异条带的干扰，但杂条带的影响仍是影响试验结果的重要原因[15]。因此，在第3轮反应中选出最适当的引物浓度，具有十分重要的作用。含Mg2+ 的buffer缓冲液主要对引物和模板的退火、Taq DNA酶的稳定起作用，当缓冲液低于一定限度不能产生条带，但用量过多也会使dNTP过量结合，非特异性条带增加，不利于反应[16-17]。与缓冲液相对应，Taq DNA酶用量的多少，同样对PCR反应存在直接影响，不同的Taq酶需要配合相应的缓冲液使用，过少无法产生条带，过多也会造成非特异性扩增[18-19]。在本试验中，较高的buffer浓度和Taq DNA酶均有利于扩增。

PCR反应中除各因素外，退火温度对目的条带的获取同样具有重要作用。相关研究发现，对热不对称PCR第3轮反应退火温度的优化，能有效地促进目的片段的富集[20]。本试验第3轮PCR反应中，特异性引物的Tm值为65 ℃，通过温度筛选得出，退火温度为64 ℃或66 ℃时，条带更为清晰。

综上所述，本研究发现，在FPNI-PCR中通过优化反应体系中各因素的浓度或用量，筛选3轮PCR的退火温度，均能有效地增加目的条带的清晰度，减少非特异性扩增，为后续研究打下良好基础，为其他物种基因启动子的研究提供一定的借鉴作用。

[HS2*2][HT8.5H]参考文献：[HT8.SS]

[ZK（#]Wang Z，Ye S F，Li J J，et al. Fusion primer and nested integrated PCR （FPNI-PCR）：a new high-efficiency strategy for rapid chromosome walking or flanking sequence cloning[J]. BMC Biotechnology，2011，11（1）：16697-16702.

[2]李昆鹏，朱化彬，郝海生，等. 基于PCR方法的基因序列全长获取策略[J]. 中国生物工程杂志，2012，32（11）：115-123.

[3]方子义. 蜡梅查尔酮合成酶基因（CHS）启动子及相关转录因子的克隆与功能分析[D]. 武汉：华中农业大学，2014.

[4]郑岑，张立平，唐忠辉，等. TAIL-PCR技术及其在植物基因中的克隆[J]. 基因组学与应用生物学，2009，28（3）：544-548.

[5]张其生，包满珠，卢兴霞，等. 大花三色堇育种研究进展[J]. 植物学报，2010，45（1）：128-133.

[6]李琴. 三色堇花色素合成结构基因的克隆与表达差异分析[D]. 海口：海南大学，2013.

[7]唐杏姣，韩科厅，胡可，等. 菊花CmDFR与CmANS基因启动子序列克隆与瞬时表达分析[J]. 生物技术通报，2012，28（5）：81-88.

[8]Dong W，You Y X，Niu L L，et al. Isolation and analysis of the promoter of an anthocyanin synthase gene from purple-fleshed sweet potato tubers[J]. Acta Physiologiae Plantarum，2014，36（10）：2637-2649.

[9]Gollop R，Even S，Colova-Tsolova V，et al. Expression of the grape dihydroflavonol reductase gene and analysis of its promoter region[J]. Journal of Experimental Botany，2002，53（373）：1397-1409.

[10][ZK（#]尚啸，王健，龚胜，等. 三色堇叶片DNA不同提取方法比较[J]. 湖北农业科学，2014，53（20）：4999-5002.

[11]刘慧，刘贯山，刘峰，等. 烟草T-DNA插入位点侧翼序列扩增方法的筛选与优化[J]. 中国烟草科学，2014，35（1）：96-101，107.

[12]李宗菊，熊丽，桂敏，等. 非洲菊基因组DNA提取及[ISSR-PCR扩增模板浓度优化[J]. 云南植物研究，2004，26（4）：439-444.

[13]罗静瑶，陈云云，谢俊，等. TAIL-PCR的技术改良及对香蕉[WTBX][STBX]NBS-RGC5[WTBZ][STBZ]基因侧翼序列的克隆[J]. 广东农业科学，2013，40（10）：143-145，170.

[14]刘阳，杨淑霞，李敏惠，等. 引物浓度与退火温度不当导致巢式PCR非特异性扩增[J]. 成都医学院学报，2008，3（2）：111-114.

[15]胡丹. 月季“月月红”酵母单杂交cDNA文库及RrMYB7诱饵载体的构建[D]. 武汉：华中农业大学，2014.

[16]Liu X D，Zheng D，Zhou Y N，et al. Restriction endonucleases digesting DNA in PCR buffer[J]. Journal of Forestry Research，2005，16（1）：58-60，85-86.

[17]王云，秦伟，王永丰. 新疆野苹果S基因特异性PCR体系优化[J]. 新疆农业科学，2013，50（11）：2023-2030.

[18]李谋强，师桂英，叶树辉，等. ‘兰州百合ISSR-PCR体系的优化[J]. 甘肃农业大学学报，2014，49（6）：76-81.

[19]周雨晴，杜沛霖，傅鹏，等. 青天葵ISSR-PCR体系优化及引物筛选[J]. 中国实验方剂学杂志，2014，20（21）：95-99.

[20]陈军营，沈向磊，辛玉茹，等. 改良TAIL-PCR技术在小麦PM H+-ATPase基因启动子克隆中的应用[J]. 河南农业大学学报，2008，42（1）：1-5.