漫晓丹++孟春花++王慧利

摘要：SLA-DRB1是影响猪体免疫反应、疾病感染和疫苗应答的重要因子。本研究对猪SLA-DRB1基因外显子3序列进行扩增和测序，筛选多态性位点，分析其与PRRSV（猪繁殖与呼吸综合征病毒）易感性的相关性。测序发现SLA-DRB1基因外显子3存在4个单碱基突变（g.17G/A、g.95C/T、g.137G/C和g.232G/C）。针对g.232G/C建立PCR-RFLP方法，检测6个猪种群共227个样本，发现在大白姜曲海杂交猪、姜曲海猪、长白猪、定远猪和杜洛克猪中有GG（0.43，0.80，0.59，0.54，0.83）和GC（0.57，0.20，0.41，0.46，0.17）2种基因型，其他群体均为GG 型。不同基因型猪肺泡巨噬细胞中PRRSV拷贝数在接毒后6、12、18、24、36 h差异均不显著（P>0.05），不同基因型猪血液中病毒载量在接毒后4、7、11、14、21、28、35、42 d差异均不显著（P>0.05），不同基因型对猪体质量和日增质量的影响不显著（P>0.05）。提示SLA-DRB1的g.232G/C突变与 PRRSV抗性无显著关联。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；SLA-DRB1基因；外显子；PCR-RFLP；易感性；碱基突变

中图分类号： S858.285.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0041-04

收稿日期：2015-04-08

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是一种高度传染性疾病，以母猪繁殖障碍和仔猪的呼吸道疾病为特征，造成怀孕母猪流产、产死胎和仔猪的高死亡率等[1]。其病原猪繁殖与呼吸综合征病毒（ PRRSV）具有高度变异性、抗体依赖性复制增强、巨噬细胞嗜性和持续性感染等特征[2]，导致现有的疫苗不能很好地控制PRRS的流行，PRRS的防治仍然是养猪业头等难题之一[3-4]。因此，猪对PRRSV的抗性也日益受到关注。国外已有多个课题组分别在体内外研究了PRRSV在不同猪种肺泡巨噬细胞（PAM）中复制和生长的特征，发现猪对PRRSV抗性或易感性存在品种（系）间的遗传差异[5]。Murtaugh 等研究了猪对PRRSV的免疫应答，指出疾病的严重性在猪品种间和群体间存在变异[6]。Ait-Ali等的研究表明PRRSV在来源于长白猪的PAM中的复制相对于其他商业遗传品系包括大白猪、皮特兰和另外2个合成系显著延迟、缓慢，然而，关于猪PRRSV抗性的遗传机制尚不清楚[7]。

猪的主要组织相容性复合物（MHC）即猪白细胞抗原（SLA），它是由紧密连锁、高度多态的基因位点所组成的染色体上的一个遗传区域，其基因产物为MHC抗原，主要功能是抗原递呈，与动物的抗病性有着密切的关系[8]。SLA按其抗原结构和功能主要分为3大类，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类，SLA-DRB1属于Ⅱ类分子。目前，国内外对SLA-DRB1基因的研究主要集中在第二外显子多态性的研究上。张冬杰等通过对 SLA-DRB1 基因整个编码区进行分析，发现突变大多集中在第二外显子处，其他3个外显子突变较少[9]。徐如海等研究表明，SLA-DRB1近端调控区存在24个多态位点，其中 G-146T 位点与仔猪大肠杆菌K88ab黏附表型存在显著的关联[10]。

Arceo等对200头杂交猪进行PRRSV攻毒时发现，高病毒载量低体质量增加组相对于低病毒载量低体质量增加组SLA-DRB1基因表达量降低，提示SLA-DRB1可能在猪抗PRRSV过程中发挥重要作用[11]，但SLA-DRB1基因多态性与猪PRRSV抗性是否关联还未见报道。本研究对2个外来猪种、3 个地方猪种和1 个杂交猪种群SLA-DRB1基因的外显子3进行测序，寻找多态性位点，同时分析其与PRRSV易感性的相关性，以期检测到与PRRSV易感性相关的分子标记，为PRRSV抗性育种提供试验依据。

1材料与方法

1.1材料

试验猪包括6个品种（或群体），共227头，其中大白姜曲海猪115头（江苏姜曲海种猪场）、姜曲海猪10头（江苏姜曲海种猪场）、长白猪37头（杭州大关猪场）、大白猪24头（杭州大关猪场）、定远猪11头（安徽省定远县猪场）、杜洛克猪30头（杭州大关猪场），每个个体取耳组织于冻存管中，置于-80 ℃中保存。PRRSV- NJGC株由江苏省农业科学院兽医研究所提供。

1.2方法

1.2.1组织样 DNA 提取耳组织样的DNA提取采用酚/氯仿抽提法，然后于-20 ℃ 保存备用。

1.2.2SLA-DRB1基因外显子3扩增参照猪SLA-DRB1基因外显子序列设计引物DRB-g3，由上海捷瑞公司合成，引物信息见表1。表1引物序列、复性温度及产物大小

引物名称 引物序列（5′→3′） GenBank

登录号 复性温度

（℃） 产物大小

（bp）DRB-g3 F：CAAGGCTCATGGCACTAACT；R：GGCATCGGTGTTTGGAGA NC_010449.4 57 659Pvu Ⅱ-SNP F：GCCCACAGTGACGGTGTAT；R：GCTGAAGGACAGGAGAACAGG NC_010449.4 56 403β-actin F：TCGCCCAACAAAACCAGT；R：TTACCCTCCCTGAATCTGACA AY550069 56 127PRRSV-N F：CCAAAGCCAACCGTGAGAA；R：CCAGAGGCGTACAGGGACA EF534357 56 207

PCR反应总体系20 μL，其中含DNA模板（100 ng/μL）2 μL，2×Power Taq PCR MasterMix 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，最终加灭菌蒸馏水至20 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸50 s，35个循环；最后72 ℃延伸7 min。PCR产物经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB）染色，检测扩增结果。

1.2.3多态位点测序筛选不同品种每5头猪 DNA 等量混合构建DNA 池，构建6个不同的DNA池，进行PCR扩增，电泳纯化后的PCR产物送上海美吉生物医药科技有限公司测序。

1.2.4PCR-RFLP分析根据测序结果选择外显子3的232 bp 处的多态位点，建立PCR-RFLP检测方法，引物 PvuⅡ-SNP 序列见表1。PCR反应总体系20 μL，其中含DNA模板（100 ng/μL）为2 μL，2×Power Taq PCR MasterMix为10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，最终加灭菌蒸馏水至20 μL。PCR扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；最后 72 ℃ 延伸7 min。PCR产物经1.5% 琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB）染色，检测扩增结果。用PvuⅡ酶对引物 PvuⅡ-SNP 扩增的PCR产物进行酶切。酶切反应体系为 20 μL，含PCR产物6 μL，PvuⅡ（10 U/μL）1 μL，10 × buffer G 2 μL，灭菌蒸馏水11 μL；37 ℃ 条件下酶切3～5 h。2.5 %琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，溴化乙锭（EB）染色，培清 JS-780全自动凝胶成像分析仪拍照分析。

1.2.5猪PRRSV易感性测定PRRSV易感性的体外测定采用PAM模型，参照 Ait-Ali 等的方法[7]进行。简要步骤如下：分离猪肺泡巨噬细胞，接种PRRSV病毒，分别在接毒后6、12、18、24、36 h收集细胞，提取RNA反转录成cDNA。针对β-actin基因、PRRSV毒株N基因序列分别设计特异性引物β-actin和 PRRSV-N （表1，由上海捷瑞公司合成） 。以各PAM细胞的cDNA为模板PCR扩增基因片段，克隆至T载体，以此为模板，SYBR Green Ⅰ染料法进行定量PCR（ ABI 7500），绘制标准曲线。以PRRSV-N基因的拷贝数与β-actin基因拷贝数的比值作为易感性的参数。每组3个重复。反应体系为20 μL，其中SYBR Premix Ex Taq （2×） 10.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，ROX 0.4 μL，模板 2.0 μL，灭菌蒸馏水6.0 μL。反应条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环，每个循环结束时收集荧光信号。

PRRSV易感性的体内测定（115头大白姜曲海猪）参照文献[11]的方法。简述如下：25日龄大白姜曲海猪背部肌肉注射法接种PRRSV病毒，分别在接毒后0、4、7、10、14、21、28、35、42 d采血，全血样本提取RNA反转录成cDNA。定量PCR检测PRRSV-N基因的拷贝数与β-actin基因拷贝数的比值，作为易感性的参数。

1.2.6数据分析猪不同基因型与PRRSV易感性及体质量和日增质量的关联分析采用SPSS 17.0软件的Independent-Samples t Test，各指标以平均值±标准误表示，P<0.05为差异显著。

2结果与分析

2.1SLA-DRB1基因外显子3的扩增及测序筛选SNP

对猪SLA-DRB1基因外显子3进行PCR扩增，扩增产物的条带为659 bp（图1），与预期结果一致。测序分析显示，在SLA-DRB1基因外显子3的17 bp处出现1个G/A单碱基突变，95 bp处出现1个C/T单碱基突变，137 bp 处出现1个G/C单碱基突变，232 bp处出现1个G/C单碱基突变（图2）。经分析，外显子3的232 bp G/C突变处于Pvu Ⅱ 酶切位点识别区，而其他3个碱基突变处无合适的限制性内切酶识别位点，因此选择232 bp处的G/C突变进一步研究。

2.2PCR-RFLP 分析

针对外显子3的232 bp处G/C 单碱基突变设计特异性引物，命名为Pvu Ⅱ- SNP。对猪DNA进行PCR扩增，扩增产物为403 bp（图3），与预期结果一致。

2.3SLA-DRB1基因群体遗传学分析

在所检测的各猪种群227个样本中SLA-DRB1基因外显子3的232位点处G/C突变只检测到GG和GC 2种基因型，除大白姜曲海猪群体以外均以GG型居多，GC型次之，G等位基因占优势（表2）。

2.4不同基因型猪群体的PRRSV易感性

比较SLA-DRB1基因外显子3的232bp突变处不同基因型猪PAM接种PRRSV后不同时间点PRRSV拷贝数，发现GG 型与GC型差异均不显著（P>0.05）（表3）；比较不同基因型猪血液中PRRSV载量，发现在接种PRRSV后不同天数GG 型与GC型差异均不显著（P>0.05）（表4）。

2.5不同基因型猪接种PRRSV后体质量及日增质量的变化

对SLA-DRB1基因外显子3的232 bp突变不同基因型共115头大白姜曲海猪进行分析，发现接种PRRSV后不同天数的体质量和日增质量差异均不显著（P>0. 05） （表5）。

3讨论与结论

主要组织相容性复合物（MHC）是由紧密连锁、高度多态的基因座所组成的染色体上的一个遗传区域[12]。它起着编码移植抗原、调节免疫应答、控制免疫球蛋白和补体的生成以及协调免疫细胞各亚群的作用，与动物的抗病性有着紧密的关联[13]。Penn等通过对小鼠的MHC研究发现，MHC的杂合型个体对病原体的抵抗和环境适应性都比纯合型强[14]。贾斌等在对新疆多浪羊和中国美利奴羊的MHC-DRBl 第二外显子进行PCR-RFLP多态性分析，发现了与包虫病抗性和易感性相关的等位基因及基因型[15]。余智勇等研究多浪羊MHC-DRB1基因的多态性时发现，该基因杂合型个体较多，而纯合型个体相对较少[16]，这可能是多浪羊对环境适应能力强的一个原因。

SLA基因是影响猪体免疫反应、疾病感染和疫苗应答反应的重要因素[17]。国内外对MHC-DRB1基因的研究多集中在其第二外显子多态性，有关该基因第三外显子多态性与猪抗病力的关联研究未见报道。Nielsen等研究发现，PRRSV感染后猪外周血中表达SLA Ⅱ类分子的免疫细胞数量增加[18]。谈永松等的研究表明，SLA-DRB1基因第二外显子Rsa Ⅰ酶切后可得到4种等位基因条带：141/93/11 bp、111/69/54/11 bp、180/54/11 bp、93/48/39/54/11 bp，分别标记为A、B、C、D。其中五指山猪分出2种带型：AA、BB；二花脸猪分出3种带型：AA、BB和AB；皮特兰猪分出3种带型：AA、CC和BD[19]。杨彤彤等采用同样方法对大约克猪、二花脸猪的SLA-DRB1基因外显子2进行了分型，发现在这2个猪种中仅存在A、B、D 等位基因[20]。徐如海等的研究表明SLA-DRB1基因外显子2中位点29、149、170对0～28日龄仔猪血清IgG含量有显著影响[10]。

本研究针对大白姜曲海杂交猪及5个不同品种猪 SLA-DRB1 基因外显子3第232 bp处G/C突变进行分析，发现该位点仅存在GC和GG 2种基因型，且除大白姜曲海杂交猪群体以外均以GG型居多，GC型次之，G等位基因是优势基因。体内外模型分析显示，SLA-DRB1基因外显子3第232 bp处G/C突变不同基因型间PRRSV拷贝数差异不显著，体质量及日增质量亦不显著，说明该SNP位点可能不是影响PRRSV抗性的位点，g.17G/A、g.95C/T、g.137G/C位点与PRRSV的抗性是否关联还有待进一步研究。

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