程　庆,　　李紫兰,　　肖玲珑,　　李春霖,杨慧婷，　　彭飞凤，　　王岐本

(湘南学院 1.南岭药用资源研究所;　2.临床学院,湖南 郴州　423000)



湖南汝城县热水温泉产酶菌的筛选

程庆1,李紫兰2,肖玲珑2,李春霖2,杨慧婷2，彭飞凤2，王岐本1

(湘南学院 1.南岭药用资源研究所;2.临床学院,湖南 郴州423000)

摘要：通过对湖南汝城县热水温泉产酶菌株的分离筛选，利用尿素酶试验和蛋白酶筛选培养基，碱性磷酸酶、氧化酶和过氧化氢酶检测方法对此前已鉴定的13株菌株进行产酶筛选，结果显示其中10株菌过氧化氢酶试验呈阳性、1株菌尿素酶试验呈阳性、9株菌氧化酶试验呈阳性、3株菌过氧化氢酶试验呈阳性和8株菌蛋白酶试验呈阳性.为嗜热微生物源工业酶研发提供基础，也可表明所筛选出的菌株在工业酶的领域具有广阔的前景.

关键词：温泉；产酶；嗜热微生物

嗜热微生物，通常是指在高温环境中生长的微生物，其最适生长温度在45℃或以上[1]，早在1969年Brock就于美国黄石国家公园的温泉中分离纯化得到水生栖热菌(Thermusaquaticus)，并测出其最适生长温度高达70℃[2].而嗜热酶则是由嗜热微生物所产生的一种具有酶活性的化合物，因其是由嗜热菌产生，故其具有一定的热稳定性，所以它在众多产业均有应用.如在某些蛋白酶在洗涤、皮革、医药、食品、饲料、化工和废处理上都有极强大工业应用潜力[3]；过氧化氢酶近年来也广泛应用于医学诊断以及纺织、造纸等工业领域[4]，而碱性磷酸酶则被广泛应用于分子生物学研究、医学临床检验、食品检验、化妆品制造、环境毒物检测及有机磷农药降解中[5]等.

郴州是华南地热资源最丰富的地区之一，所属的南岭山地是我国重要生物区系的分界线.郴州汝城温泉是我国南方水温最高，流量最大，水质最好，热田面积最宽的天然温泉.因此，本次研究在前期湖南汝城热水温泉微生物资源多样性的研究基础上[6]，从湖南汝城的温泉水样品中分离纯化嗜热微生物，在16S rDNA基因测序的13株菌株基础上，对产蛋白酶、尿素酶、碱性磷酸酶、氧化酶、过氧化氢酶菌株的筛选进行了初步研究，为嗜热微生物源工业酶的开发和利用提供实验依据.

1材料与方法

1.1样品采集

实验样品采自湖南省汝城县热水镇，北纬25°31′47.29″，东经113°54′48.19″.A：68 ℃，藻类，B：94 ℃，泥水混合物，C：86 ℃，泥水混合物，D：90 ℃，泥水混合物.

1.2菌种来源

本次研究所用的菌种为利用DSM88培养基于60 ℃恒温培养，分离纯化所得到的菌株R1、R2、R3、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13和R14[6].

1.3主要仪器和试剂

立式压力蒸汽灭菌锅(江阴滨江医疗设备有限公司)；上皿电子天平(上海精科天平)；超净工作台(济南洁康空气净化设备厂)；电热恒温培养箱(北京市永光明医疗仪器有限公司)；电子万用炉(浙江省上虞市道墟宝民仪器设备厂)；eppendorf移液枪(德国).酪蛋白(AR)，葡萄糖(AR)，酵母膏(AR)，K2HPO4·3H2O(AR)，MgSO4·7H2O(AR)，Vogel’s微量元素液(AR)，二甲基对苯二胺(AR)，对硝基苯磷酸二钠(PNPP)(AR)，0.2M Tris-HCl(AR)，蛋白胨(AR)，NaCl(AR)，酚红(AR)，KH2PO4(AR)，琼脂(AR).

1.4培养基

1.4.1DSM88培养基

配制100×10 ml/L，(NH4)2SO4(1.3 g/L)、KH2PO4(0.28 g/L)、CaCl2·2H2O(0.07 g/L)、MgSO4·7H2O(0.25 g/L)、FeCl3·6H2O(20 mg/L)，(1 000×)稀有元素(1 ml/L)，MnSO4·H2O(2.2 mg/L)、Na2B4O7·10H2O(4.5 mg/L)、ZnSO4·7H2O(0.5 mg/L)，1 000×1 000倍(1 ml/L),CuSO4(0.016 mg/L)、NaMoO4·2H2O(0.025 mg/L)、CoCl2·6H2O(0.046 mg/L)，Yeast extract(1.0 g/L)、Tryptone(1.0 g/L).调PH值至7.6(1 mol/LNaOH，4.0 g溶于100 ml蒸馏水内；1 mol/LHCl，3.65 g溶于100 ml蒸馏水内)灭菌，121 ℃ 20 min，25 g琼脂.

1.4.2尿素酶试验培养基

蛋白胨1 g，葡萄糖1 g，NaCl 5 g，酚红0.012 g，KH2PO42 g，琼脂15 g，加蒸馏水至1 000 mL.

1.4.3蛋白酶筛选培养基

酪蛋白40 g，葡萄糖40 g，酵母膏4.0 g，K2HPO4·3H2O 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，Vogel’s微量元素也0.1 ml，加蒸馏水至1 000 ml，最后调节PH至7.6.

1.5方法

1.5.1菌株的活化

将此前已保好种的菌种接种于DSM88培养基，置于60 ℃恒温培养箱中进行复壮，直至出现单个菌落.

1.5.2碱性磷酸酶试验

将菌置于60 ℃恒温培养箱中培养24 h，把浸有底物溶液的滤纸片贴在菌落上，再重新放入培养箱，3 min后取出观察，若滤纸片变黄，则说明该株菌落碱性磷酸酶试验呈阳性.底物溶液2.0 mg/mL对硝基苯磷酸二钠(PNPP)溶于pH=8.9的0.2 M Tris-HCl缓冲液.

1.5.3氧化酶试验

在洁净玻片上滴二甲基对苯二胺的1%溶液，用接种环挑取已活化的菌苔，若在10 s内涂抹的菌苔呈红色则试验为阳性.

1.5.4过氧化氢酶试验

用接种环在固体培养基上挑取菌落，置于洁净玻片上，滴加3%过氧化氢溶液2 mL，观察结果，于半分钟内产生气泡者为阳性，不产生气泡者为阴性.

1.5.5蛋白酶筛选试验[7]

在种子培养基中加入1.2%的明胶.用穿刺法将试验菌接种在培养基中，60 ℃中培养4 d.将试管从培养箱中取出,置于4 ℃冰箱中.

1.5.6尿素酶试验

挑取18～24 h待试菌培养物涂布并穿刺接种于DSM88固体斜面培养基，不要到达底部，留底部作变色对照.培养2，4和24 h分别观察结果，如阴性应继续培养至4 d，作最终判定，变为粉红色为阳性.

2结果

2.1菌株形态及革兰染色观察

根据BaSO快速革兰氏染色说明书(制片、初染、媒染、脱色、复染、镜检)对分离培养出3 d的菌革兰氏染色.结果显示5株菌革兰染色呈阳性，除R1为短杆状和R3为球状之外，其余均为长杆状，如表1和图1.

表1　13株菌株的菌落形态及革兰染色

图1　几种菌株的菌落形态及革兰氏染色结果

2.213株菌产酶试验结果

产酶试验结果显示10株菌过氧化氢酶实验呈阳性，1株菌尿素酶试验呈阳性,9株菌氧化酶试验呈阳性，3株菌过氧化氢酶试验呈阳性，8株菌蛋白酶试验呈阳性(表2).

表2　13株菌产酶试验结果

3讨论

嗜热酶具有化学催化剂无法比拟的优点，尤其是在高温条件下能保持极好的稳定性，克服了常温酶在应用过程中出现的化学性质不稳定现象[8].且因其在高温条件下特殊的耐受及催化功能，在工农业生产方面有着广阔的应用前景.因此，它可极大地促进嗜热微生物源工业的发展以及各类生物技术产业的发展.

本次研究主要针对蛋白酶、尿素酶、碱性磷酸酶、氧化酶、过氧化氢酶这5种酶进行了检测.经试验，R5、R6和R7碱性磷酸酶试验均为阳性,且前期鉴定该三种菌种均属于亚栖热菌属(Meiothermus)，龚宁萍[7]对云南栖热菌产耐热性磷酸酶及菌种鉴定的研究中已经筛选出31株碱性磷酸酶阳性菌，且这31株菌均属于栖热菌属，而2002年Mr Chen[9]从台湾分离得到台湾亚栖热菌新种(Me.taiwanensis),可见亚栖热菌属也分布郴州地区；R3、R5、R6、R7、R8、R9、R11和R12蛋白酶试验为阳性,任佩[10]等从章鱼肠道内分离出6种产蛋白酶菌株,其最适生长温度为55-60 ℃，这是多种蛋白酶共同作用的所产生的结果,而本研究所产生的蛋白酶则是在60 ℃条件下产生,极有可能为这8株菌株在最适温度时所产生的某一种或多种蛋白酶,由于不同种属的细菌所产蛋白酶种类和其最适温度都不同,故在60 ℃时可能还有一部分蛋白酶并未表现出其最大的活性,因此这8株菌株还有产其他多种蛋白酶的潜在可能性，为湖南汝城地区的嗜热蛋白酶的进一步研究奠定了一定的基础.

R2、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R12和R13氧化酶试验为阳性,目前氧化酶在酶应用技术方面是一种重要的酶,如葡萄糖氧化酶,它可制成试剂盒用于实验室葡萄糖的定量测定[11]，还可以用于防止食品褐变等方面,在食品快速检测及生物传感器上也有广泛应用[12].由于国内葡萄糖氧化酶的研究水平还不高,故本研究可极大的丰富氧化酶的开发和利用资源；R1、R2、R5、R6、R7、R9、R10、R11、R12和R13过氧化氢酶试验阳性,其余为阴性,即在本实验中4种亚栖热菌R2、R5、R6和R7属能产过氧化氢酶,在目前产过氧化氢酶菌株的大量研究中,有关亚栖热菌属产过氧化氢酶的研究尚少,表明这两种菌株的成功分离提供了新的过氧化氢微生物资源,利于该地区过氧化氢酶资源的开发和利用;R8尿素酶为阳性,结果表明在试验的13株菌株里面只有土芽孢杆菌属的R8可产尿素酶,此前,邱波[13]等人对7株副溶血性弧菌在不同温度的条件下进行了尿素酶反应检测比较,结果显示不同温度和不同方法检测的结果存在一定的差别,阳性菌株的血清型和型别构成存在差别,在本研究中,R8能产尿素酶,说明其血清型和型别构成也和其他同属阴性菌株存在一定的差别,为后续的土芽孢杆菌属细菌的进一步研究提供了一个基础.

本研究所进行的过氧化氢酶、尿素酶、氧化酶、碱性磷酸酶和蛋白酶试验在工业酶的领域具有广阔的前景.在本研究的基础上，能进一步深入多糖与酶的研究，并测定碱性磷酸酶和蛋白酶的温度及PH生长曲线，为其在工业生产方面发挥更大的作用奠定了基础.

参考文献：

[1]Madigan Mt.,Oren A.Thermophilic and halophilic extremophiles[J].Current Opinion in Microbiology,1999(2):265-269.

[2]Brock Td.,Freeze H.Thermus aquaticus gen n and sp n,a nonsporulating extreme thermophile[J].Journal of Bacteriology,1969(1):289-297.

[3]刘芳.一株产蛋白酶海洋菌的鉴定、发酵条件优化和酶的性质研究[D].青岛:青岛科技大学，2013.

[4]张增祥,王伟,郝建华，等.产过氧化氢酶菌株CE-1的筛选与鉴定[J].海洋科学,2010(11):54-57.

[5]王素芳,陆唯哲,吴融融，等.产碱性磷酸酶菌株的筛选及鉴定[J].中国酿造,2010(12):126-129.

[6]程庆,李春霖,王岐本，等.不同培养基对湖南汝城温泉微生物分离培养探究[J].湘南学院学报，2015(5):31-35.

[7]龚宁萍.云南热泉栖热菌产耐热碱性磷酸酶的研究及其菌株鉴定[D].云南:昆明理工大学，2004.

[8]王冬梅,白复芹.嗜热酶的稳定性及其应用前景[J].山东大学学报(自然科学版),2006(3):477-478.

[9]Chen C,Lin L,Peng Q,Ben K,et al.Meiohtermus rosaceus sp.nov.isolated from Tengchong Rehai inYunnan,China.FEMS microbiol.Lett.,2002(216)：263-268.

[10]任佩,金玉兰,朴美子.章鱼肠道产蛋白酶菌的筛选、产酶条件及酶学性质[J].食品科学,2013(1):189-193.

[11]鲁统部,杨惠英,计亮年.葡萄糖氧化酶的提纯方法[J].中国医药工业杂志，1996(4):185-189.

[12]朱运平,伍少明,李秀婷.微生物葡萄糖氧化酶的生产及其在食品工业中应用的研究进展[J].中国食品添加剂,2013(5):165-172

[13]邱波,姚斐,王本利.产尿素酶副溶血弧菌的病原学研究[J].职业与健康，2015(5):40-41.

[14]朱华.产葡萄糖氧化酶工程菌发酵条件优化[D].保定：河北农业大学，2012

[15]魏涛,杜聪聪,毛多斌，等.超嗜热细菌thermotoga maritima酯酶TM1350克隆、表达及其酶学性质研究[J].食品工业科技，2015(9):179-183.

[16]马晓梅,赵辉.淀粉酶产生菌MSP13筛选及其产酶条件初步优化[J].食品科学，2015(11):177-181.

[17]李杨,蔡海莺,赵敏洁，等.高产耐高温脂肪酶生产菌的筛选与鉴定[J].生物技术通报，2015(1):144-150.

[18]刘兰.云南腾冲及西藏曲才地热区可培养高温厌氧细菌多样性研究[D].昆明：云南大学,2015.

Screening Rucheng County,Hunan Hot Spring Enzyme Producing Bacteria

CHENG Qing1,LI Zi-lan2,XIAO Ling-long2,LI Chun-lin2

YANG Hui-ting2,PENG Fei-feng2,WANG Qi-ben2

(1.SouthRidgeDrugResourcesResearchOffice；2.ClinicalMedicineSchool,XiangnanUniversity,Chenzhou,Hunan423000)

Abstract：By separating and selecting the Hunan Rucheng County hot spring enzyme producing strains.Previously identified 13 strains were enzyme screened by using urease test and protease screening medium,alkaline phosphatase,oxidase and catalase detection method.The result showed among 13 isolates strains there were 10 strains was positive in catalase test,1 strain was positive in urease test,9 strains was positive in oxidase test,3 strains was positive in catalase test and 8 strains was positive in protein enzyme test.These results providing the basis for research the thermophilic microbial source industrial enzyme,It may also indicating that selected strains have broading prospects in the field of industrial enzyme.

Key words：hot spring；producing enzyme；thermophilic microorganism

收稿日期：2016-04-12

基金项目:湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划(湘教通[2015]269号);国家级大学生创新创业训练计划项目(201510545004);湖南省教育厅重点科研项目(12A127);中南林业科技大学对口支援湘南学院项目(2012XN03).

作者简介：程庆，1983年生，女，湖南湘阴人，硕士研究生，研究方向：微生物；

*通讯作者:王岐本，1967年生，男，湖南邵阳人，教授，研究方向：微生物.

中图分类号：Q93

文献标识码：A

文章编号：1671-9743(2016)05-0052-04