张玉杰，赵　燕，徐　璐，张乾义，陈　锴，孙永芳，邹兴启，朱元源，赵启祖，宁宜宝，王　琴

（中国兽医药品监察所/国家猪瘟参考实验室，北京 100081）



RNA可视化原位杂交技术对感染细胞中猪瘟病毒RNA定位与分布

张玉杰，赵燕，徐璐，张乾义，陈锴，孙永芳，邹兴启，朱元源，赵启祖，宁宜宝，王琴

（中国兽医药品监察所/国家猪瘟参考实验室，北京 100081）

摘要：【目的】为研究CSFV RNA在体外感染细胞中的分布及定位，建立了一种准确、敏感的RNA可视化原位杂交技术。【方法】本研究通过比对GenBank中公布的CSFV、BVDV和BDV全序列，避开BVDV和BDV的同源区，设计了CSFV RNA及内参基因β-actin的特异探针。以CSFV中等致病力毒株（HeBHH1/95）为参考毒株，在PK15细胞中培养病毒，加入RNA可视化原位杂交的特异探针和相应试剂，采用荧光共聚焦显微镜进行成像观察。通过综合分析观测结果、荧光强度、重复性等因素，采用正交试验优化了对原位杂交过程中具有重要影响的蛋白酶K浓度和甲醛固定时间，建立了CSFV RNA可视化原位杂交技术，并与FAT方法比较该技术灵敏度；用我国目前流行的CSFV 1.1、2.1、2.2、2.3基因亚型及BVDV、PPV、PRV和PCV-2病毒进行特异性试验。最终，以CSFV强致病力毒株（SM）接种PK15细胞，病毒感染后0.5、1、3、6、8、10、14、18、24、36、48、72、96h（hours post inoculation，hpi）取样，每个时间点2个重复，采用CSFV RNA可视化原位杂交技术进行检测。为佐证病毒蛋白在细胞中的定位及分布，同时采用FAT方法对SM株E2蛋白在PK15细胞中的表达情况进行动态研究。【结果】采用该技术在荧光共聚焦显微镜下可观察到CSFV RNA在细胞中的定位；当蛋白酶K浓度为1∶1 000、甲醛固定时间为30min时为最优反应条件；灵敏度试验表明该技术对病毒的检测极限为10-8/200µL，比FAT高3.5个数量级；……