不同品种观赏贝母花粉活力与萌发率比较

2016-07-14郝丽红杨柳慧于晓南

西北农业学报 2016年7期

关键词：花粉粒贝母染色法

郝丽红，陈　燕，杨柳慧，于晓南,3

(1.北京林业大学园林学院，北京　100083；2.北京市植物园，北京　100093；3. 城乡生态环境北京实验室，北京　100083)

不同品种观赏贝母花粉活力与萌发率比较

郝丽红1，陈燕2，杨柳慧1，于晓南1,3

(1.北京林业大学园林学院，北京100083；2.北京市植物园，北京100093；3. 城乡生态环境北京实验室，北京100083)

贝母是一种极具观赏价值与发展潜力的球根花卉。采用氯化三苯基四氮唑(TTC)、碘-碘化钾(I2-KI)染色法对10个品种(种)观赏贝母的新鲜花粉的生活力进行测定，同时采用离体培养法对各品种花粉的萌发率进行测定。综合2种测定方法发现，伊贝母的花粉活力最高，托里贝母、花格贝母和大白花贝母花粉活力相对较高；在离体培养时，培养基为1 g/L硼酸+150 g/L蔗糖时，花粉萌发率最高；-20 ℃干燥环境有利于花粉的贮藏。

观赏贝母；花粉生活力；花粉萌发率

贝母是百合科贝母属(FritillariaL.)一类球根花卉，具有较高的观赏价值和药用价值[1]。近年来，欧美国家以观赏为目的，将贝母用于庭院种植、布置环境，也有的被制作盆景或作切花[2]。贝母属植物不仅种类繁多、姿态各异、生活型多样，而且分布广泛，是重要的园林花卉应用材料[3]。目前，国际上流行的几个贝母品种不仅花大、色艳，而且球茎较大，茎秆较高、粗壮。而国内的贝母种类虽多，但多茎秆较细，种球较小。想要培育出具有以上二者优点、性状良好的贝母品种，可借助杂交手段进行培育。但了解各贝母种的花粉活力与萌发情况是首先必须解决的问题。

花粉萌发是植物有性生殖的重要环节之一，在杂交育种与多倍体繁育中，花粉的质量是亲本选择的重要指标之一，而花粉生活力的测定是保证花粉质量最为有效的途径之一[4]。柱头萌发检测法能够准确检测出花粉的活性，但需在品种数量较多的情况下测定。因此，使用比较多的测定方法主要有花粉离体萌发测定和染色法。目前对其他植物花粉活力检测的研究[5-7]较为多见，而关于贝母花粉活力的测定研究较少。本试验对北京地区引种栽培的10个国内外贝母品种(种)的花粉活力与萌发率进行测定，以期筛选出生活力较高的种类，为杂交时的人工授粉、杂交组合方案的制定及种质资源的保存提供科学依据。

1材料与方法

1.1花粉采集与处理

试验所用的10个品种(种)观赏贝母花粉分别采自北京植物园和小汤山国家花卉工程中心苗圃。于晴天9:00―11:00时用镊子摘下盛花期微开花朵的花药，用硫酸纸包好，放入冰盒内带回实验室，置于室内24 h阴干，使其散出花粉，晾干后收集花粉备用。

1.2测定指标与方法

1.2.1花粉生活力测定采用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法[8]及碘-碘化钾(I2-KI)染色法[9]测定花粉生活力。分别用胶头滴管吸取质量浓度为5 g/L的TTC和I2-KI溶液，分别将其滴于粘有花粉粒的载玻片上，盖上盖玻片，于室温下(约25 ℃)放置15 min后在显微镜下观察花粉粒的着色情况。当用TTC染色法时，有活力的花粉被染成红色(活力较强)或淡红色(活力较弱)，当用I2-KI染色法时，凡被染成蓝色的为含有淀粉的活力较强的花粉粒，黄褐色的为发育不良的花粉。每个处理均设3次重复，每个重复取3～5个视野，不少于50个花粉粒，总计观察花粉数大于150粒，统计花粉粒总数和有活力的花粉粒数。按下列公式计算花粉生活力。

花粉生活力=变红色(变蓝色)的花粉粒数目/花粉粒总数×100%

1.2.2花粉萌发率测定以质量浓度为1 g/L的硼酸溶液为基本液体培养基，采用单因素(蔗糖)试验，蔗糖质量浓度梯度分别为50、100、150 g/L。采用分别在4 ℃和-20 ℃下干燥贮藏7 d的花粉进行试验。

将培养液滴于凹形载玻片内，用解剖针蘸取适量花粉均匀散于培养液中，然后将其放于带有湿滤纸的培养皿中并加盖，在恒温培养箱中培养12 h，用显微镜观察花粉的萌发情况。每个处理均设3次重复，每个重复观察统计3～5个视野，不少于50个花粉粒，总计观察花粉数大于150粒，以花粉管长度大于等于花粉粒直径作为萌发依据。

贮藏试验采用以上试验筛选出的最优培养基进行萌发试验。均按下列公式计算花粉萌发率。

1.3数据处理

运用Excel 2007和SPSS 17.0对各试验结果进行处理，并进行相关分析。

2结果与分析

2.1不同测定方法对贝母花粉活力的影响

对10个观赏贝母品种用TTC染色法和I2-KI染色法进行生活力的测定，经观察、统计并计算，得到的结果如表1所示。由表1可以看出，不同贝母品种的花粉生活力不同，并且2种方法所得的结果不同，在某些种类上数据相差悬殊。用TTC染色法时各品种的花粉活力为7.04%～71.11%，最低为皇冠贝母‘极点露波拉’，最高为伊贝母。而用I2-KI染色法时，各品种花粉活力为27.03%～81.58%，最低为波斯贝母‘阿德亚曼’，最高为皖贝母。对于单一的贝母品种(种)，2种方法结果相差较大的是皇冠贝母‘极点鲁特’，较为接近的为波斯贝母‘阿德亚曼’和伊贝母。方差分析表明，不同贝母品种(种)之间花粉生活力存在显著差异，如TTC染色法中，除托里贝母、花格贝母和皖贝母之间无显著差异外，其他贝母品种(种)间均存在显著差异。I2-KI 染色法中，不存在显著差异的贝母品种(种)相对较多，如伊贝母与托里贝母、花格贝母和大白花贝母。综合2种染色测定方法，认为TTC染色法效果不明显，着色困难(图1-A)，而I2-KI染色法结果较为理想(图1-B)。

2.2不同质量浓度蔗糖对贝母花粉萌发率的影响

对10个不同观赏贝母品种(种)的花粉在不同质量浓度蔗糖的培养基上培养12 h后的萌发率进行测定，经观察、统计、计算后，进行方差分析，结果如表2所示。由表2可以看出，在质量浓度50 g/L的蔗糖下，花粉活力最高的是伊贝母(60.71%)，最低的是黄花贝母(25.00%)，除波斯贝母‘阿德亚曼’、波斯贝母‘象牙钟’和托里贝母之间无显著差异外，其他各品种(种)之间差异显著。当蔗糖质量浓度为100 g/L时，花粉活力最高的是波斯贝母‘象牙钟’(95.40%)，最低的是波斯贝母‘阿德亚曼’(39.13%)，多数贝母品种(种)间差异显著。当蔗糖质量浓度为150 g/L时，测得的花粉活力最高的是托里贝母(94.74%)，最低的是皇冠贝母‘极点鲁特’。由此可见，不同品种的花粉在同一培养基上的萌发率也存在一定差异。但当硼酸质量浓度不变时，同一品种的花粉在不同质量浓度蔗糖的培养基上花粉的萌发率存在显著差异，并且多数品种(种)的萌发率随着蔗糖质量浓度的升高而升高。当蔗糖质量浓度为150 g/L时，除皇冠贝母‘极点鲁特’和波斯贝母‘象牙钟’的萌发率较低外，其余各品种(种)的萌发率均达75%以上。因此认为，在1 g/L硼酸溶液的培养基上，比较适合贝母花粉萌发的蔗糖质量浓度为150 g/L，在此条件下多数贝母花粉的萌发率均较高(图1-C)。

A.TTC染色照片　TTC dyeing；B.I2-KI染色照片　I2-KI staining；C.花粉萌发照片　Pollen germination

表1　不同方法测定的贝母花粉生活力±s)

注：同列中不同小写字母表示在0.05水平上差异显著，下同。

Note:Different lowercase letters in the same column indicated significant difference at 0.05 level, the same as below.

表2　不同质量浓度蔗糖处理下贝母花粉的萌发率±s)

2.3不同贮藏温度对贝母花粉萌发率的影响

由以上试验结果可知，较为理想的培养基为1 g/L硼酸+150 g/L蔗糖，因此，进行贮藏试验时选择该培养基进行萌发率的测定试验，培养时间为12 h，结果如表3所示。发现不同贮藏条件下花粉的萌发率存在显著差异。在4 ℃条件下贮藏7 d后，花粉的萌发率最高的是花格贝母，但也只达到17.34%，最低的是波斯贝母‘阿德亚曼’，只有3.24%。而在-20 ℃条件下贮藏7 d后，发现花粉萌发率最高的是托里贝母，达到89.76%，最低的是皇冠贝母‘极点露波拉’，为32.93%。可见，在4 ℃下贮藏，各贝母品种(种)的花粉萌发率有明显的下降，而在-20 ℃条件下贮藏7 d后，花粉的活力整体虽有所下降，但下降幅度较小，只有皇冠贝母‘极点露波拉’和波斯贝母‘阿德亚曼’2个品种的萌发率降到55%以下，其余各品种还能保持70%以上的萌发率，说明在―20 ℃的干燥环境下贮藏有利于花粉活力的保持。

表3　不同贮藏条件下贝母花粉的萌发率±s)

3结论与讨论

通过对观赏贝母的10个品种(种)新鲜花粉的生活力测定和贮藏性初步研究，认为TTC染色法和I2-KI染色法对所测的贝母花粉活力结果不太准确，若要作粗略测定，建议采用I2-KI染色法，或者筛选较为合适的TTC质量浓度，而离体培养法能反映花粉实际的萌发情况，结果较为准确。综合染色法和培养法这2种方法的测定结果，发现伊贝母的花粉活力最高，其次为托里贝母、花格贝母和大白花贝母；较为有利的培养基为1 g/L硼酸+150 g/L蔗糖；较为有利的贮藏条件为-20 ℃的干燥环境。

多数植物正常花粉呈规则形状，而发育不良的花粉常呈畸形。TTC花粉活力检测法是利用花粉的呼吸作用，因为有活力的花粉在呼吸过程中可以产生二氢烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐(NADPH2)或者二氢烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH2)，将TTC还原为红色的三苯基甲酯(TTF)从而使花粉粒着色[10]。但在本试验中，发现多数花粉粒用TTC染色时着色量较少，测得的活力值较小，分析原因可能是因为花粉粒的结构较为特殊，使染色液不易浸入，或者因为染色液的质量浓度较小，导致结果偏低，但导致其染色率低的真正原因还需进一步研究。

花粉离体萌发测定法是在花粉离体条件下创造适宜花粉萌发的外界环境条件，促进花粉萌发及花粉管的伸长。该方法测定的是花粉的真正萌发情况，能够较为真实地反映花粉的活力情况。由本试验可得皇冠贝母‘极点鲁特’和波斯贝母‘象牙钟’这2个品种的萌发适宜培养基为1 g/L硼酸+100 g/L蔗糖，其余品种(种)适宜的培养基为1 g/L硼酸+150 g/L蔗糖，其萌发率均在75%以上。因此认为，蔗糖的质量浓度对花粉萌发起促进作用，在做杂交时可考虑在柱头上涂抹一定质量浓度的蔗糖溶液，以提高其萌发率。由于本试验未对硼酸的质量浓度进行梯度试验，并且也未考虑其他因素，所以最为合适的硼酸质量浓度和最为合适的培养基组合还不甚清楚。

通过贮藏性试验发现，随着贮藏时间的加长，花粉的萌发率逐渐降低，4 ℃干燥贮藏条件下花粉的萌发率下降较快，而-20 ℃的干燥条件对花粉活力的保持较为有利，这和娄晓鸣等[2]研究认为较低的温度对贮藏是有利的结论一致。以后可以考虑应用-20 ℃低温和超低温的方法对花粉进行贮藏，并建立花粉库，以使花粉更好的在实际中应用[11]，也可使种质资源以花粉的形式长期安全保存。

Reference：

[1]梁松筠.百合科( 狭义) 植物的分布区对中国植物区系研究的意义[J].植物分类学报,1995,33(1):27-51.

LIANG S Y.Chorology ofLiliaceae(S.Str.)and its bearing on the ChineseFlora[J].ActaPhytotaxonomicaSinica,1995,33(1):27-51(in Chinese with English abstract).

[2]娄晓鸣,成海钟,朱旭东.观赏贝母花粉生活力及贮藏性研究[J].江苏农业科学,2007,35(1):101-102.

LOU X M,CHENG H ZH,ZHU X D.Research on pollen viability and storage of ornamental fritillaries[J].JiangsuAgriculturalSciences,2007,35(1):101-102(in Chinese).

[3]郝丽红,汤正娇,于晓南.贝母属6个新疆野生种质调查及其园林应用初探[J].浙江农业学报,2014,26(3):661-666.

HAO L H,TANG ZH J,YU X N.Investigation on germplasm resources of sixFritillariain Xinjiang and their landscape application[J].ActaAgriculturaeZhejiangensis,2014,26(3):661-666(in Chinese with English abstract).

[4]马慧.不同倍性芍药新品种染色体核型分析和花粉形态观察[D].北京：北京林业大学,2014.

MA H.Study on ploidy and pollen morphology of new partial paeonies[D].Beijing:Beijing Forestry University,2014(in Chinese with English abstract).

[5]周蕴薇,刘芳,李俊涛.百合花粉生活力及贮藏特性[J].东北林业大学学报,2007,35(5):39-40,46.

ZHOU Y W,LIU F,LI J T.Vitality and storage capacity of asiatic lily pollen[J].JournalofNortheastForestryUniversity,2007,35(5):39-40,46(in Chinese with English abstract).

[6]穆金艳,杜晓华,贾文庆,等.大花三色堇花粉生活力测定及贮藏方法[J].西北农业学报,2013,22(9):158-162.

MU J Y,DU X H,JIA W Q,etal.Pansy pollen viability determination and its storage method[J].ActaAgriculturaeBoreali-occidentalisSinica,2013,22(9):158-162(in Chinese with English abstract).

[7]贾文庆,尤扬,刘会超,等.鸢尾花粉生活力测定及贮藏特性研究[J].西北农业学报,2012,21(8):182-185.

JIA W Q,YOU Y,LIU H CH,etal.Determination ofIristectorumpollen viability and its storage method[J].ActaAgriculturaeBoreali-occidentalisSinica,2012,21(8):182-185(in Chinese with English abstract).

[8]胡适宜.植物胚胎学实验方法(一)花粉生活力的测定[J].植物学通报,1993,10(2):60-62.

HU SH Y.Experimental methods in plant embryology (Ⅰ) determination of pollen viability[J].ChineseBullletinofBotany,1993,10(2):60-62(in Chinese with English abstract).

[9]李合生.植物生理生化实验原理和技术[M].北京：高等教育出版社,2000:207-209.

LI H SH.Principle and Technology of Plant Physiological and Biochemical Experiments[M].Beijing: Higher Education Press,2000:207-209(in Chinese)

[10]李宗平,张俊杰,彭灏,等.烟草花粉活力鉴定方法筛选[J].中国烟草科学,2013,34(4):80-82.

LI Z P,ZHANG J J,PENG H,etal.Screening for optimum method of tobacco pollen vigor evaluation[J].ChineseTobaccoScience,2013,34(4):80-82(in Chinese with English abstract).

[11]BAJAJ Y P S.Effect of super-low temperature on excised authers and pollen embryos of Atropa,nNicotiana and Petunia[J].Phytomorphology,1978,28:171-176.

Pollen Vitality and Germination Rate of Different Varieties of OrnamentalFritillaries

HAO Lihong1, CHEN Yan2, YANG Liuhui1and YU Xiaonan1,3

(1.College of Landscape Architecture, Beijing Forestry University, Beijing100083, China;2.Beijing Botanical Garden, Beijing100093, China; 3.Beijing Laboratory of Urban and Rural Ecological Environment, Beijing100083, China)

The genusFritillariais a kind of bulb flower with high ornamental value and developmental potential. The staining method of TTC and I2-KI were used to test pollen vitality of 10Fritillariaspecies or cultivars in this article, at the same time, the germination of pollen were tested in vitro culture. The result showed that the highest pollen vitality wasF.pallidiflora, followed byF.tortifolia,F.meleagrisandF.verticillatavar.albiflora. Pollen had the highest germination rate in the optimal combination of culture medium, 1 g/L boronic acid+ 150 g/L sucrose.In addition, the vitality of pollen was kept under dry conditions at -20 ℃.

OrnamentalFritillary; Pollen vitality; Germination rate of pollen

2015-06-07

2015-07-09

Co-building Program of Beijing Municipal Commission of Education (No.BLCXY201527).

HAO Lihong, female,master student.Research area:garden flower culture. E-mail: haolihong1986@163.com

YU Xiaonan, female,Ph.D,professor,doctoral supervisor.Research area:garden plant cultivation and breeding. E-mail: yuxiaonan626@126.com

(责任编辑：史亚歌Responsible editor:SHI Yage)

2015-06-07修回日期：2015-07-09

北京市教育委员会科学研究与研究生培养共建项目(BLCXY201527)。

郝丽红，女，硕士研究生，研究方向为园林花卉栽培。E-mail:haolihong1986@163.com

于晓南，女，博士，教授，博士生导师，研究方向为园林植物栽培育种。E-mail:yuxiaonan626@126.com

S682.2