于　飞，张文越，梁　璐，杨　军

(中国医科大学 公共卫生学院 营养与食品卫生学教研室，辽宁 沈阳 110122)



2型糖尿病对雄性小鼠听觉功能及内耳Otoferlin、VGLUT3、Myosin Ⅶa蛋白表达的影响

于飞，张文越，梁璐，杨军

(中国医科大学 公共卫生学院 营养与食品卫生学教研室，辽宁 沈阳 110122)

[摘要]目的观察2型糖尿病对雄性小鼠听觉功能，静纤毛超微结构和耳畸蛋白(Otoferlin)、囊泡谷氨酸转运体3(vesicle glumate transporter 3，VGLUT3)、肌球蛋白 Ⅶa(MyosinⅦa)蛋白表达的影响。方法按体重将12只6周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为两组(对照组和糖尿病组，n=6)。对照组小鼠食用饲料含铁量为(8.26±2.67)mg/kg，糖尿病组小鼠食用饲料含铁量为(8.39±1.03)g/kg。在实验开始前及实验第4、8、12、16周时测定小鼠血糖，实验第16周时测定葡萄糖耐量及胰岛素耐量，测定听觉诱发电位。分离左侧耳蜗基底膜，用免疫荧光法观察Otoferlin、VGLUT3与Myosin Ⅶa在内外毛细胞的定位与分布。分离右侧半数耳蜗用作western blot分析蛋白表达，另外半数耳蜗分离基底膜，用扫描电镜观察内毛细胞静纤毛形态。结果实验第8、12、16周，糖尿病组小鼠血糖水平升高，与对照组比较差异有显著性意义(P<0.05)。糖尿病组小鼠糖耐量减弱，胰岛素抵抗指数升高，与对照组比较差异有显著性意义(P<0.05)。糖尿病组小鼠听力诱发电位阈值在刺激频率为2和3 kHz时升高，与对照组比较差异有显著性意义(P<0.05)。糖尿病组小鼠内毛细胞静纤毛排列正常，未见紊乱及数目减少；糖尿病组Otoferlin在内毛细胞底部表达减少，与对照组比较差异有显著性意义(P<0.05)。 结论2型糖尿病致雄性小鼠听觉功能损伤，可能与Otoferlin 蛋白在耳蜗毛细胞中表达下调有关。

[关键词]听觉功能；2型糖尿病；耳畸蛋白

[引用本文]于飞，张文越，梁璐，等.2型糖尿病对雄性小鼠听觉功能及内耳Otoferlin、VGLUT3、Myosin Ⅶa蛋白表达的影响[J].大连医科大学学报，2016,38(2)：109-113，117.

糖尿病是以高血糖为主要特征的慢性代谢性疾病，可造成人体微血管和神经病变，当其对内耳微循环造成损害时，会使听觉功能表现出不同程度下降。目前，对糖尿病性听力损伤的发病机制主要集中在血管病变、神经病变、代谢异常、遗传基因学等方面[1]。内耳毛细胞对于各种耳毒素表现敏感，其数目、形态及功能异常可导致听力损伤[2]。Otoferlin、VGLUT3与Myosin Ⅶa蛋白在内耳毛细胞表达，对维持正常听觉功能发挥重要作用。Otoferlin蛋白属于ferlin蛋白家族，在成熟小鼠耳蜗内毛细胞特异性表达，并集中表达于内毛细胞基底膜外侧，Otoferlin与其它突触前膜蛋白相似，参与膜融合，跟突触结合蛋白1、胞浆磷脂酶A2等结合，并维持细胞内外钙离子浓度稳定，通过调控突触囊泡胞吐作用，参与完成耳蜗带状突触传递功能[3]。另外，谷氨酸作为神经递质，主要储存在神经元的囊泡中，并以囊泡的形式运输至神经末梢，而VGLUT是负责将末梢胞质中的谷氨酸逆浓度转运至囊泡中的特异转运蛋白。VGLUT3是耳蜗内毛细胞唯一的VGLUT[4]。而肌球蛋白是真核细胞内的一类分子马达，对细胞的运动与传输起着重要的作用，其中Myosin Ⅶa就是一类在细胞体内负责运输的分子，它的功能对于内耳毛细胞发育尤为重要。Myosin Ⅶa发挥内耳毛细胞静纤毛的铆接、胞浆内小囊泡和颗粒的运动[4]。目前鲜见2型糖尿病对听觉功能及相关蛋白表达影响的报道。因此本研究拟观察2型糖尿病对听觉功能、内毛细胞静纤毛及Otoferlin、VGLUT3与Myosin Ⅶa蛋白表达的影响。

1材料和方法

1.1主要试剂与仪器

羰基铁(沈阳化学试剂有限公司)，羊抗鼠耳畸蛋白(Otoferlin)(美国Santa Cruz公司)，兔抗鼠囊泡谷氨酸转运体3(vesicle glumate transporter 3，VGLUT3)(美国Abcam公司)；兔抗鼠肌球蛋白Ⅶa(Myosin Ⅶa)(美国Sigma公司)；驴抗羊Alexa Fluor 488 IgG (美国Invitrogen公司)；DAPI染料(美国Santa Cruz)；胰岛素放免试剂盒(美国Linco公司)。血糖仪(德国罗氏公司)；隔声屏蔽室(中国医科大学附属一院耳鼻喉科)；诱发电位仪(美国Tucker-Davis Technologies公司)；扫描电镜(日本JEOL公司)，激光扫描共聚焦显微镜(德国Leica公司)。

1.2实验动物分组与处理方法

健康6周龄清洁级雄性C57BL/6J小鼠12只(体重为19～21 g)，中国医科大学实验动物中心提供[SCXK(辽)2003-0009，CMU62033008]。动物双侧耳廓反射灵敏，饲养环境安静，有良好的通风和空气过滤系统，室温21 ℃左右，相对湿度50%左右，采用灯光照明，明暗各12 h。实验动物适应性饲养1周，按体重随机分为两组，每组6只，对照组小鼠摄入正常饲料，含铁量为(8.26±2.67)mg/kg饲料，糖尿病组小鼠摄入铁过量饲料，含铁量为(8.39±1.03)g/kg饲料，饲料配方参照以前研究[5]。

1.3血糖及葡萄糖耐量、胰岛素抵抗测定

小鼠分别喂养两种饲料，在喂养前、喂养满4、8、12和16周时，尾静脉采血测血糖或胰岛素，在喂养刚好满16周时，每组小鼠经尾静脉采血留样后，从晚12点至次日清晨8点禁食，然后进行胰岛素抵抗测验，尾静脉采血，分离血清，留做空腹血糖、胰岛素测定用，然后将葡萄糖(2 g/kg)或胰岛素注射液(0.5 units/只)腹腔注射，分别于15、30、60及120 min，尾静脉取血，用血糖仪测定血糖；放免试剂盒测定胰岛素；胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=快速血糖(mg/dL)×快速胰岛素(μU/mL)/2430。

1.4听觉诱发电位阈值检测

小鼠进行葡萄糖耐量及胰岛素耐量试验后，经乙醚麻醉，进行听性脑干反应阈值检测。隔声屏蔽室内，保持动物体温，应用TDT system 3系统进行测听。带通滤波宽度为50～5000 Hz，持续时间10 ms，平均叠加次数1024次。刺激声为click，短纯音刺激在1、2、3、4 kHz下具有1 ms平段，强度范围为10～90 dB 声压级，衰减间隔10 dB，直至无法引出可以重复的听性脑干反应波形，然后以5 dB SPL幅度提高刺激强度，以Ⅲ波刚出现的声刺激强度来判断听觉诱发电位阈值。

1.5 耳蜗内毛细胞静纤毛超微结构

小鼠听性脑干反应阈值检测后，断头处死，分离右侧耳蜗，取半数耳蜗，迅速取出颞骨，打开听泡，暴露耳蜗后浸入2.5%戊二醛固定液中，灌流后于2.5%戊二醛溶液中4 ℃过夜，10%乙二胺四乙酸脱钙液内脱钙7 d；镜下于0.l mmol/L磷酸盐缓冲液中剥除蜗壳，去除螺旋韧带、前庭膜及盖膜；l %四氧化饿固定2 h；磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5 min，梯度酒精脱水，环氧树脂浸透包埋、聚合、修块，超薄切片机切片，乙酸铀和柠檬酸铅染色，采用透射电子显微镜进行超微结构观察。

1.6免疫荧光检测Otoferlin、VGLUT3与Myosin Ⅶa定位

小鼠听性脑干反应阈值检测后，断头处死，分离左侧耳蜗基底膜，用免疫荧光法观察Otoferlin、VGLUT3与Myosin Ⅶa在内毛细胞的定位与分布。将基底膜置于0.5 %Triton X-100中30 min，用磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次5 min；用山羊血清封闭后室温孵育30 min，去封闭液，滴加一抗，湿盒中4 ℃孵育过夜，再用磷酸盐缓冲液洗3次，每次5 min；然后滴加Alexa Fluor 488标记的荧光二抗，湿盒中室温避光孵育1 h；再用磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次5 min。镜下铺片，DAPI染核，甘油封片；共聚焦激光扫描显微镜下观察。

1.7Western blot检测Otoferlin、VGLUT3与Myosin Ⅶa表达

小鼠听性脑干反应阈值检测后，断头处死，分离右侧半数耳蜗用作western blot分析蛋白表达，提取耳蜗总蛋白，用Bradford法定量蛋白浓度，垂直电泳分离蛋白，转膜，进行一抗及二抗孵育，曝光后扫描并对检测蛋白进行半定量分析。

1.8统计学方法

2 结果

2.1小鼠一般生理及生化指标的测定结果

与对照组比较，糖尿病组体重在16周喂养期间增长减缓，在喂养满4、8、12和16周时，糖尿病组体重比对照组降低，差异有显著性意义(P<0.05)；血糖水平在喂养8周后明显升高，差异有显著性意义(P<0.05)；HOMA-IR在喂养16周后明显升高，差异有显著性意义(P<0.05)。糖尿病组小鼠血糖水平在葡萄糖耐量结束时60、120 min与对照组比较仍然较高，差异有显著性意义(P<0.05)，但在葡萄糖耐量结束时15、30 min与对照组比较无差异；血糖水平在胰岛素耐量实验各检测时间点均明显升高，差异有显著性意义(P<0.05)。见表1。

2.2小鼠听性脑干反应阈值检测结果

与对照组比较，糖尿病组听性脑干反应阈值在2和3 kHz下升高，差异有显著性意义(P<0.05)。见图1。

表1　小鼠生理及生化指标比较

葡萄糖耐量为注射葡萄糖后血糖水平，胰岛素耐量为注射胰岛素后血糖水平。1)与对照组比较，P<0.05

2.3小鼠耳蜗内毛细胞静纤毛超微结构

两组小鼠耳蜗内毛细胞静纤毛排列规则，2型糖尿病并未引起小鼠耳蜗内毛细胞静纤毛自然缺失及束转位。见图2。

2.4Otoferlin、VGLUT3与MyosinⅦa在小鼠耳蜗内毛细胞中的分布与表达

如图3所示，对照组Otoferlin免疫阳性反应产物主要分布于耳蜗内毛细胞底部，外毛细胞纤毛也有非特异性着色(图3A)。糖尿病组Otoferlin免疫阳性反应产物分布与对照组分布相似，但荧光强度明显减弱(图3B)。Western blot结果显示，Otoferlin在两组均有表达，但糖尿病组的表达显著低于对照组(P<0.05)(图3C)。

如图4和5所示，VGLUT3和MyosinⅦa阳性反应产物呈红色荧光耳蜗基底膜铺片。Western blot结果显示，VGLUT3和Myosin Ⅶa在两组均有表达，但差异无显著性意义(P>0.05)。

图1　小鼠听性脑干反应阈值Fig 1 ABR thresholds of mice in 2 groupsA:两组听阈变化代表曲线图；B: 听性脑干反应阈值*与对照组比较，P<0.05

图2　小鼠耳蜗内毛细胞静纤毛超微结构(标尺为10 μm)Fig 2 Ultra-structure of stereocilia in cochlear inner hair cells of mice (scale bars=10 μm)A：对照组；B：糖尿病组

图3　小鼠Otoferlin在耳蜗内毛细胞的表达分布(标尺为10 μm)Fig 3 The distribution and expression of Otoferlin in cochlear inner hair cells of mice (scale bars=10 μm)A：对照组(红色荧光代表Otoferlin，蓝色荧光代表DAPI)；B：糖尿病组； C：两组Otoferlin蛋白表达比较 *与对照组比较，P<0.05

图4　小鼠VGLUT3在耳蜗内毛细胞的表达分布(标尺为10 μm)Fig 4 The distribution and expression of VGLUT3 in cochlear inner hair cells of mice (scale bars=10 μm) A：对照组(红色荧光代表VGLUT3，蓝色荧光代表DAPI)；B：糖尿病组；C：两组VGLUT3蛋白表达比较

图5　小鼠Myosin Ⅶa在耳蜗内毛细胞的表达分布(标尺为10 μm)Fig 5 The distribution and expression of Myosin Ⅶa in cochlear inner hair cells of mice (scale bars=10 μm) A：对照组(红色荧光代表Myosin Ⅶa，蓝色荧光代表DAPI)；B：糖尿病组；C：两组Myosin Ⅶa蛋白表达比较

3讨论

2型糖尿病可能是听力下降的独立危险因素，其最突出的临床特征是造成胰岛素抵抗，继而出现高血糖。机体高血糖会通过各种机制直接或间接损害内耳血管及神经结构，从而导致感音神经性听力下降[6]。本实验通过摄入含铁过多饲料，制造外源性铁过载致胰岛素抵抗动物模型，用来模拟人群普通2型糖尿病发生。选用C57BL/6J小鼠，是由于其相对于其它种类小鼠，更容易出现感音神经性耳聋[7]，选用雄性小鼠是为了减少自身内分泌因素对建立胰岛素抵抗的影响[4]。生理及生化结果证明动物模型后期表现出糖耐量减弱及胰岛素抵抗状态，并出现高血糖，提示模型建立成功。但本实验只设立一个剂量，无法观察到剂量效应关系，而且糖尿病组小鼠体重明显低于对照组动物，表明受试物对动物有一定的毒性作用，而毒性可能影响各种观察指标的变化。较为理想的实验结果是即使造模也应选择无明显毒性而造模又好的剂量。这些将是今后进一步相关试验亟待解决的问题。

听觉诱发电位是测试听觉功能的常用临床方法。本实验结果显示，2型糖尿病引起小鼠高频段听力损失较重，但低、中频未表现出明显损失。另外，本实验中2型糖尿病小鼠在刺激频率4 kHz下虽表现听性诱发电位阈值升高，但差异无显著性意义。本实验扫描电镜结果显示，在2型糖尿病状态下，小鼠耳蜗内毛细胞静纤毛结构并未损伤。而有文献报道，2型糖尿病可引起耳蜗血管纹及螺旋神经节受损[5]。所以推测，一方面由于小鼠机体的内稳态作用在一定程度上代偿2型糖尿病造成的听力损伤，另一方面由于本实验造模的方式和糖代谢紊乱的程度与其它研究不同。

动物实验表明，2型糖尿病可引起内耳缝隙连接通道功能出现异常，钾离子再循环过程受阻，从而影响内淋巴液中钾离子浓度，破坏内淋巴稳态，进而导致毛细胞变性及耳蜗内电位缺失[8]。特别是Otoferlin在成年小鼠耳蜗中仅在内毛细胞表达，尤其在内毛细胞基底外侧部，集中在带状突触的囊泡上，与内流钙离子结合，定向释放到突触前膜的结合位点，激活预先固定于结合位点处的突触相关膜蛋白复合体，促使突触囊泡与质膜紧密融合，释放神经递质。另外，Otoferlin基因敲除小鼠表现为感音性聋[2]。本实验结果显示，2型糖尿病下调Otoferlin在雄性小鼠内耳毛细胞表达，表明2型糖尿病可影响内毛细胞神经递质释放。本实验发现2型糖尿病并未影响小鼠VGLUT3、Myosin Ⅶa在内耳毛细胞的表达。研究表明，VGLUT3能将耳蜗内毛细胞末梢谷氨酸逆浓度转运至囊泡中，缺乏VGLUT3的突变小鼠由于内耳感觉毛细胞和传入神经元之间的谷氨酸传送缺失，表现听力完全丧失，听觉脑干反应存在缺陷[4]。表明2型糖尿病未改变耳蜗内毛细胞谷氨酸传递；另一方面，Myosin Ⅶa参与毛细胞运动及递质传输功能，Myosin Ⅶa缺失可造成耳聋[4]，由此表明2型糖尿病未改变耳蜗静纤毛运动及部分神经递质运输。这与本实验并未造成2型糖尿病雄性小鼠耳蜗静纤毛结构改变相一致。因此推测，2型糖尿病引起听觉功能异常，可能与Otoferlin表达下调相关。今后笔者将对2型糖尿病与Otoferlin调控相关通路变化作进一步研究。

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Effects of type 2 diabetes on auditory function and expression of Otoferlin, VGLUT3 and Myosin Ⅶa proteins in inner ear in male mice

YU Fei, ZHANG Wen-yue, LIANG Lu, YANG Jun

(DepartmentofNutritionandFoodHygiene,SchoolofPublicHealth,ChinaMedicalUniversity，Shenyang110122,China)

[Abstract]Objective To observe the effects of type 2 diabetes in auditory function, ultrastructure of stereocilia, expression of Otoferlin, VGLUT3 and Myosin Ⅶa proteins inner ear in male mice. Methods Twelve C57BL/6J male mice aged 6 week old were randomly assigned evenly to two groups (control group and diabetic group). Control group and diabetic group was fed a diet with iron content (8.26±2.67) mg/kg and (8.39±1.03) g/kg, respectively. Blood glucose levels were measured before and 4, 8, 12, 16 weeks after iron-content diet feeding. Glucose tolerance test and insulin tolerance test, auditory brainstem response (ABR) test were performed at 16 weeks after iron-content diet feeding. The basilar membranes of the left cochleae were separated for assessment of the location of Otoferlin, VGLUT3 and MyosinⅦa in inner and outer hair cells by immunofluorescence. One half of right cochleae were used for assessment of protein expressions by western blot, the other half were used for assessment of the morphology of stereocilia by scanning electron microscope. Results Compared with control group, blood glucose levels were significantly higher in diabetic group at 8, 12, 16 weeks after iron-content diet feeding (P<0.05); and glucose levels of mice from diabetic group were significantly higher at 0, 60, 120 mins after the end of glucose tolerance test(P<0.05), and HOMA-IR index of mice from diabetic group were significantly higher (P<0.05). The ABR threshold shifts of mice in diabetic group were significantly higher at 2, 3 kHz frequencies (P<0.05). The location of stereocilia of cochlear inner hair cell was normal in mice from diabetic group.The Otoferlin expression in the diabetic group was down-regulated in basal of inner hair cell compared with control group (P<0.05). Conclusion Abnormal auditory function in male mice of diabetic group might be related with the down-regulated expression of Otoferlin protein in cochlear hair cells.

[Key words]auditory function; type 2 diabetics; Otoferlin

作者简介：于 飞(1980-)，男，山东牟平人，副教授。E-mail: yufei@mail.cmu.edu.cn

doi:论著10.11724/jdmu.2016.02.02

[中图分类号]R994.6

[文献标志码]A

文章编号：1671-7295(2016)02-0109-05

(收稿日期：2015-12-11；修回日期：2016-03-10)