左其生，王颖洁，赵瑞丰，程少泽，汪怡临，靳　锴，王　飞，

纪艳芹，路镇宇，张文慧，张亚妮*，李碧春*

(扬州大学动物科学与技术学院，扬州 225009)



CRISPR/Cas技术可有效介导家鸡基因敲除

左其生，王颖洁，赵瑞丰，程少泽，汪怡临，靳锴，王飞，

纪艳芹，路镇宇，张文慧，张亚妮*，李碧春*

(扬州大学动物科学与技术学院，扬州 225009)

本研究旨在家鸡上建立一种高效、稳定的基因组定点编辑技术体系，实现目的基因定点敲除，为后续家鸡基因编辑提供操作依据。基于NCBI数据库提供的CDS序列克隆C2EIP(chr2，Expression In PGC) 基因全长，并根据基因序列中APM的位置设计特异性gRNA1、gRNA2和gRNA3，并构建cas9/gRNA载体；将设计好的cas9/gRNA转染状态良好的DF-1，利用Luciferase SSA重组检测法、T7E1酶切法以及TA克隆测序法检测gRNA在DF-1细胞中基因的敲除效率。Luciferase SSA重组检测结果表明，只有cas9/gRNA3载体具有基因敲除活性，荧光活性比对照组高两倍，T7E1酶切结果显示cas9/gRNA3基因的敲除活性为27%，TA克隆测序结果表明，30个测序菌液中有8个菌液出现不同数目的碱基缺失或增加，初步估计基因敲除效率为26%。通过本研究在家鸡中初步建立了cas9介导的基因敲除技术，该技术能够稳定的在鸡的细胞DF-1上介导基因敲除。

CRISPR/Cas；基因敲除；鸡

鸡作为经典的发育生物学模型，因其鸡胚获取方便，数量大，被广泛的应用于探索基因在细胞分化过程中具体调控机制的研究[1]。家鸡的基因功能验证目前主要是通过过表达的方式，即通过干细胞介导法来产生转基因鸡或嵌合体鸡[2]，但是对家鸡的基因敲除目前国内外尚无研究。

CRISPR/Cas基因敲除技术被广泛的应用于模式动物并能稳定的介导基因的敲除。……