魏自民，吴俊秋,，赵越，杨天学，席北斗，时俭红，文欣，李东阳

1.东北农业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨　1500302.中国环境科学研究院国家环境保护地下水污染模拟与控制重点实验室，北京　100012



堆肥过程中氨基酸的产生及其对腐植酸形成的影响

魏自民1，吴俊秋1,2，赵越1，杨天学2*，席北斗2，时俭红1，文欣1，李东阳2

1.东北农业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨1500302.中国环境科学研究院国家环境保护地下水污染模拟与控制重点实验室，北京100012

摘要为探明堆肥过程中氨基酸(AA)浓度与腐植酸(HAs)形成的关系，分别以杂草(LW)、鸡粪(CM)、枯枝(GW)、蔬菜(CW)和秸秆(CS)为研究对象，研究其堆肥过程中AA及HAs的动态变化规律及二者的响应关系。结果表明：堆肥过程中AA浓度整体呈下降趋势，其中LW、CS中的AA浓度降低量(90.7%和80.9%)明显高于CM(67.4%)、GW(51.3%)和CW(50.1%)；而在堆肥过程中HAs浓度逐渐升高，其中LW中的HAs浓度增加量最大(66.8%)，其次为CW(38.9%)、CS(43.9%)和CM(33.6%)，而GW最小，仅为3.5%。Pearson相关性分析表明：堆肥过程中LW、CW和CS中的AA与HAs浓度之间呈显著负相关(P<0.05)，说明纤维素类物料的AA对HAs形成有明显的促进作用。

关键词堆肥；腐植酸；氨基酸；相关性分析

堆肥作为一种腐殖化技术，可以将不同来源的有机固体废物转化成为稳定的化合物。有机质在堆肥过程中经过微生物分解转化成最具代表性的副产物——腐植酸(humic acids，HAs)。研究表明，HAs分子结构上连接有多种活性官能团，这些官能团可以有效改善土壤的结构和活性[1]。例如，HAs结构中的官能团赋予了HAs较高的离子交换能力，对于缓解重金属、农药和多环芳烃对环境造成的危害具有重要作用[2-3]。同时，HAs作为高含碳量的大分子化合物对提高土壤养分，平衡土壤含碳量同样具有重要作用[4]。因此，提高堆肥中的HAs产量对于环境修复具有重要意义。

在对HAs形成机制的研究中发现，HAs的前体物质能够促进HAs合成、提高HAs的产量以及分子量[5]。这些物质主要包括一些氨基酸(AA)、大分子的糖类、脂肪、多酚、醌以及多肽等[6]，其中，AA在HAs大分子的聚合阶段起重要作用。有机废物堆肥研究证实，多酚作为HAs合成的前体物质，通过与氨基化合物或多糖的缩合促进HAs的形成[7]。相关学者同样通过外源官能团的添加研究了HAs前体物质对HAs形成的影响，结果表明，向堆肥中添加葡萄糖能够显著加快堆肥的稳定[4,6]，而AA的添加能够明显提高HAs的分子量[8]。根据以上研究证实，在HAs的合成途径中，游离AA可以作为促成HAs聚合的最终官能团，促进多种小分子聚合物形成大分子HAs，多种有关HAs形成的理论同样反映出了AA对HAs大分子形成的重要作用。

HAs的形成主要包括多酚途径、木质素途径以及美拉德反应途径(又称糖-胺缩合途径)[9]。这些途径的差别在于合成HAs的前体物质不同，构成了不同的HAs芳香族核心。由木质素分解或微生物合成的多酚、醌基等芳香化合物都是构成HAs核心的重要基团[10]。由这些基团聚合形成的难降解的芳香族核心最终会与游离AA、多糖等物质聚合形成HAs[11]。而在环境中多酚、醌、还原糖、AA等物质是共同存在的，所以自然条件下HAs的形成途径并不是相互独立的，而是多种途径相互作用完成HAs分子的聚合和转化[12]。根据HAs的合成途径可以发现，HAs在形成过程中都要与AA进行缩合从而形成大分子聚合物，因此AA对合成HAs大分子具有重要意义。同样，美拉德反应途径为，有机质分解出来的AA的氨基和还原糖的醛基生成了难降解的褐色多聚氮的化合物，强调了AA在HAs形成过程中的重要性。

然而，目前对HAs形成途径的研究多集中于堆肥过程中多酚的变化对HAs形成的影响[7,13-14]，来源于不同物料中AA的形成规律及其对HAs合成的作用研究还很少。笔者以不同有机废物为研究对象，探究不同结构组成的物料在堆肥过程中AA浓度的动态变化规律以及AA对HAs形成的作用。

1材料与方法

1.1堆肥试验

堆肥试验场地依托上海美圣环保科技有限公司(上海松江固体废物综合处理厂)，采用二次发酵堆肥工艺，对鸡粪(CM)、杂草(LW)、枯枝(GW)、蔬菜(CW)以及秸秆(CS)5种物料于发酵车间统一进行好氧堆肥，周期为50 d。堆体长3 m，宽2 m，高1.5 m，在堆肥过程中每周进行1次翻堆，通风、透气。

所有的样品均采自工厂附近，由于江南地区湿度大，为避免堆肥厌氧发酵，堆肥前要对物料进行预处理，并对各样品进行基本理化指标的测定。所选物料的基本性质如表1所示。将所获得的物料进行剪碎处理，颗粒直径为1.5～3.0 cm，便于物料的腐熟。将采集的含水率高的样品放在阴凉通风处3～5 d，使其含水率低于60%，堆肥前测定各种物料的含水率，并添加适量的蒸馏水使各物料的含水率达到50%～60%。用秸秆和鸡粪作为调节剂，调节初始CN为20～25。在不同堆肥时间测量堆肥温度。采用四分法收集样品(总量500 g)，分别于堆肥的第0、8、16、20、24、28、32、38、44、50天取样，所有样品冻干，研磨，并贮存于-20 ℃冰箱备用。

表1　蔬菜(CW)、杂草(LW)、鸡粪(CM)、枯枝(GW)和

1.2分析方法

HAs的提取与测定[15]：取5 g堆肥干样，按照1 g∶10 mL的比例加入0.1 molL的焦磷酸钠和氢氧化钠混合溶液，在24 ℃下200 rmin振荡24 h。将获得的悬浊液在4 ℃下12 000 rmin离心20 min，上清液过0.45 μm滤膜，采用岛津TOC-VcpH有机碳分析仪测定HAs浓度。

游离AA的浸提与测定[16]：将采集的堆肥样品按照1 g∶10 mL的比例用1 molL KCl浸提，200 rmin振荡30 h后过滤，滤液中的AA浓度采用茚三酮比色法测定。

1.3统计分析

采用SPSS 19.0、Origin 8.0软件对试验数据进行统计分析。

2结果与讨论

2.1堆肥过程中AA浓度的动态变化规律

在HAs形成的美拉德反应途径中，分解产物AA和还原糖是构成该途径的重要因素。虽然堆肥的物料结构组成不同，但在分解过程中产物AA普遍存在。说明任何物料在堆肥过程中都会有美拉德途径存在，并且影响着HAs分子的性质和浓度。

不同物料堆肥过程中游离AA浓度的动态变化如图1所示。由图1可见，堆肥初期各物料中的AA浓度各不相同，其中，CM中的AA浓度最高，为1 725.6 μmolg，高于LW(432.1 μmolg)和GW(292.6 μmolg)，而CW和CS中的AA浓度最低，仅为55.7和32.5 μmolg。引起这种差异的主要原因是物料组成的不同。AA作为生命活动的基本物质，是各有机物料的重要组成部分。研究表明，CM中含有大量的粗蛋白和丰富的AA[17]；而CS作为禾本科植物是以纤维素为主要结构的物质，AA以及粗蛋白类物质含量较低。

在堆肥前期(第0～16天)，LW、GW、CW和CS中的AA浓度均呈上升趋势，且于第8～16天达到最大值，仅CM处于下降趋势。LW、GW、CW和CS中的AA浓度最大值分别为1 109.7、534.8、64.1和48.9 μmolg，其AA浓度较原始物料分别增加了61.0%、45.1%、13.1%和33.5%。即LW的增幅最大，其次是GW，而CW的增幅最小。其原因在于CM中的粗蛋白含量较高；GW和CS作为禾本科植物和木本科植物物料，其木质化程度较高；而LW和CW作为草本植物，是以纤维素为主要结构的物质。所以，堆肥过程中草本物料以及木本物料中物质的分解对AA的形成都有一定的促进作用。堆肥是物质的分解和合成共同存在的过程，但堆肥的初期微生物新陈代谢剧烈，物质的分解占主体[18]。微生物将易分解的大分子化合物分解为小分子物质，这些小分子一部分作为能源和碳源供微生物的生命活动，另一部分作为前体物质合成HAs[11]。在CM堆肥中，AA作为微生物的主要碳源以及能源被大量利用，使AA浓度在堆肥初期呈下降趋势。但LW、GW、CW和CS中微生物以利用多糖为主，为AA的积累提供了条件，所以这些物料在堆肥前期AA浓度呈上升趋势。

图1　不同物料堆肥过程中游离氨基酸浓度的动态变化Fig.1　The dynamic of amino acids concentrationof different materials composting

随着堆肥的进行，各物料的AA浓度逐渐下降并趋于稳定。在第16～50天随着物质的分解作用逐渐减弱，腐殖化作用逐渐增强，简单的氨基酸态氮向复杂形态的氮转化[19-20]，使各物料堆肥中AA浓度逐渐下降。到堆肥结束(第50天)，LW、CM、GW、CW和CS中的AA浓度分别为103.0、309.3、174.6、31.2和24.4 μmolg，与堆肥初期的最大值相比LW中的AA浓度降低最大(90.7%)，其次是CM(82.1%)，而CS(50.1%)和CW(51.3%)的AA浓度降幅最小，GW(67.4%)居中。表明堆肥过程中以纤维素和蛋白质为主要结构的物料中，AA浓度降幅较大。该现象可能是由于纤维素和蛋白质容易被微生物分解，产生大量的小分子物质可以供微生物利用，进而更好地促进微生物对蛋白质的分解利用以及AA向HAs的转化。

2.2堆肥过程中腐植酸的形成

HAs在农业、工业以及环境修复等行业具有重要的应用价值，研究不同物料堆肥过程中HAs浓度变化规律对调控HAs合成速度，增加HAs浓度具有重要理论及现实意义。

由图2可见，不同物料HAs形成规律在堆肥各时期有所不同，LW、GW和CW在堆肥前期(第0～16天)HAs浓度呈下降趋势，随后逐渐上升并趋于稳定。而CS和CM在整个堆肥过程中的HAs浓度都呈上升趋势。在堆肥的初始物料中都提取出了HAs物质，其中GW的HAs浓度最高(79.3 mgg)，LW最低(43.7 mgg)。说明各物料自身都含有一些与HAs结构类似的物质[21]，而以木质素为主要成分的物料含有较多的类HAs物质。Adani等[4]研究认为，堆肥的腐殖化过程是木质素衍生物经过去羧基、去甲氧基以及烷基氧和烷基碳的再聚合形成的，所以GW原始物料的HAs浓度相对较高。堆肥过程中HAs的形成是一个演化的过程，一方面物料中原有的类HAs物质逐渐转化成成熟的HAs[10]，另一方面部分HAs是由有机质或微生物残体在分解过程中形成的低分子量的疏水分子重新整排聚合而成的超分子结构[22]。Amir等[23]对堆肥中HAs结构的研究发现，堆肥过程中HAs的形成最重要的部分来源于木质素类物质的结构演化。

图2　不同物料堆肥过程中腐植酸形成的动态变化规律Fig.2　The formation of HAs during differentmaterials composting

在堆肥前期(第0～16天)，各物料的HAs浓度呈现不同的下降趋势：LW先升高再降低，CW先降低后升高，而CM和CS则呈现升高的趋势。CW在堆肥的第8天HAs浓度降到最小值(57.1 mgg)，降幅为2.7%；LW和GW在第16天HAs浓度达到最小值(33.8和52.8 mgg)，分别下降了23.1%和33.4%。其中HAs浓度降幅最大的是GW，虽然GW中含有大量木质素不易被微生物利用，但是木质素上连接有许多脂肪链，可以被微生物作为能源消耗或合成自身结构[24]。同时，原始物料中含有的类HAs物质结构简单松散，容易水解[25]，在堆肥前期微生物大量繁殖，首先利用易降解的有机碳和简单的有机质进行新陈代谢以及矿化[26]，堆肥前期甚至中期阶段微生物利用类HAs结构物质作为能源使HAs浓度降低。屠巧萍等[25]的研究表明，在堆肥前期也有较弱的腐殖化作用存在，但是主要还是以物料的矿化作用为主。

到堆肥后期(第38～50天)所有物料的HAs浓度快速上升并逐渐趋于稳定。LW、GW、CW、CS和CM的HAs浓度为121.7，82.1，95.9，85.3和118.4 mgg，HAs浓度升幅最大的是LW(66.8%)，其次为CW(38.9%)、CS(43.9%)以及CM(33.6%)，最低的是GW(3.5%)。说明在堆肥过程中纤维素含量高的物料更容易形成HAs。HAs形成的多酚途径认为纤维素在堆肥过程中降解产生的大量多酚化合物能够直接与氨基化合物缩合形成HAs[27]，所以在LW、CW和CS纤维素含量高的物料中HAs浓度增加明显。木质素的抗微生物降解性以及GW中蛋白质含量较低，致使GW堆肥后期HAs浓度上升较慢。而CM在堆肥中HAs的增长速率较慢且稳定时间较长，主要是因为蛋白质类虽然为HAs形成提供氨基化合物，但由于缺少构成HAs核心的基团，致使HAs的形成速率以及稳定时间都较慢。

2.3氨基酸浓度与腐植酸形成之间的相关性分析

AA作为HAs形成的前体物质，其在HAs形成过程中可能发挥的作用可以通过二者间浓度的相关性分析得到的。Pearson相关性分析结果表明(图3)，AA浓度与HAs浓度间呈负相关关系。在LW、CW和CS堆肥中二者相关性显著(P<0.05)，其中，CW和CS的相关性概率值达到P<0.01水平，相关性极显著。但在CM和GW堆肥中二者之间的相关性不显著。

图3　不同物料堆肥过程中游离氨基酸与腐植酸浓度的相关性分析Fig.3　The relationship between free amino acid and humicacids concentration during different organic wastes composting

上述结果表明，以纤维素为主要结构的物料在堆肥过程中游离AA对HAs形成的促进作用明显。HAs的形成途径表明，与HAs形成相关的多种官能团最后都是通过与AA的缩合形成HAs大分子[9]，所以，AA浓度的降低是由于合成了HAs。Mecozzi等[28]的研究指出，HAs的形成过程是糖类化合物与AA以氢键相连的主要反应。同样，Zhang等[5]的研究也表明，堆肥物料中的含氮有机物有助于HAs分子的形成，其通过向物料中添加对二苯酚研究含氮化合物对HAs形成的影响时发现，添加的对二苯酚为HAs的形成提供碳骨架，物料中的氨基取代苯环上的氢原子形成复合物分子，这一过程加快了HAs形成的速率，提高了HAs的分子量。堆肥过程中，AA参与HAs的形成是通过美拉德反应实现的。纤维素的降解产物还原糖连同AA是该反应的重要前体物质[29]。根据王晓明的研究，CM是以粗蛋白为主要成分的物料，粗纤维和粗脂肪含量较少[17]。堆肥过程中粗蛋白分解产生大量的AA，但由于结构中缺少构成HAs的核心碳源，使CM堆肥中AA对HAs形成的促进作用不明显。而GW堆肥中AA对HAs形成促进作用不明显可能是由于GW中含有大量的木质素类物质，难被微生物降解的同时还缺少AA的来源，形成的HAs分子可能主要是以芳香结构为主。

3结论

(1)不同物料堆肥过程中AA浓度呈降低趋势，其中以纤维素和蛋白质为主要结构的物料AA浓度的降低程度较大。

(2)堆肥过程中各物料HAs浓度逐渐升高。纤维素含量高的物料HAs生成量最大，木质素最低，蛋白质居中，说明纤维素的分解促进了HAs的生成。

(3)AA浓度与HAs形成之间的相关性分析发现，AA作为HAs形成的前体物质促进HAs的合成，且源于纤维素物料中的AA对HAs形成的促进作用明显。

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Production of Amino Acids and Its Effect on the Formation of Humic Acids during Composting

WEI Zimin1, WU Junqiu1,2, ZHAO Yue1, YANG Tianxue2, XI Beidou2, SHI Jianhong1, WEN Xin1, LI Dongyang2

1.College of Life Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China2.State Environmental Protection Key Laboratory of Simulation and Control of Groundwater Pollution,Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China

AbstractThe dynamic of amino acids (AA) concentration and the influence on the formation of humic acids (HAs) were investigated during composting of cabbage waste (CW), lawn waste (LW), chicken manure (CM), garden waste (GW) and corn straw (CS). The results showed that AA concentration was decreased during composting process. The decrease in LW (90.7%) and CS (80.9%) was more than CM (67.4%), GW(51.3%) and CW(50.1%). During the composting process, the HAs concentration was gradually increased. The increment of HAs concentration in LW (66.8%) was higher than CW (38.9%), CS(43.9%) and CM(33.6%), while GW was only 4.6%. The significantly inverse correlations have been obtained between AA and HAs concentration during LW, CW and CS composting, suggesting that AA derived from the cellulose materials composting can observably promote the formation of HAs.

Key wordscomposting; humic acids; amino acids; correlation analysis

收稿日期：2016-01-21

基金项目:国家自然科学基金项目(51178090)

作者简介：魏自民(1969—)，男，教授，博士生导师，研究方向为环境生物化学,weizm691120@163.com *通讯作者：杨天学(1983—)，男，博士后，研究方向为固体废弃物处理,ytx13@126.com

中图分类号:X705

文章编号:1674-991X(2016)04-0377-07

doi:10.3969�j.issn.1674-991X.2016.04.056

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