刘滨++刘新富++曾霖++孟振++刘江春

摘 要：报道了一种可以快速、灵敏地检测七带石斑鱼神经坏死病毒（NNV）的逆转录环介导等温扩增方法（RT-LAMP）。该方法参考赤点石斑鱼NNV病毒的主衣壳蛋白（MCP）基因的保守序列，设计1对引物克隆出七带石斑鱼NNV的基因序列，利用Primer Explorer V4 软件设计了3对针对所克隆NNV基因序列的特异性引物，建立了RT-LAMP的反应体系，并分别对反应系统的引物浓度、反应温度和时间进行了优化，形成了七带石斑鱼NNV病毒RT-LAMP检测技术。实践应用结果表明，在63 ℃的最佳反应温度下，采用RT-LAMP检测技术经过45 min就能完成一次检测，准确率达到100 %。本研究建立的RT-LAMP检测NNV技术设备要求简单，为七带石斑鱼等石斑鱼无NNV受精卵和仔稚鱼的生产现场检测和筛选提供了一种方便、灵敏的检测方法。

关键词：七带石斑鱼；神经坏死病毒；检测；RT-LAMP

中图分类号：S941 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.07.006

Abstract：A rapid and sensitive technique for detecting of Nervous Necrosis Virus in seven-band grouper was developedthrough reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification（RT-LAMP） method. A set of six specific primers were designed based on MCP gene of Red-spotted Grouper Nervous Necrosis Virus （ RGNNV） using Primer Explorer V3 software. The parameters of primer concentration， reaction time and temperature were optimized.The RT-LAMP method established in this article was applied to detect nervous necrosis virus of seven-band grouper larvae in the fish farming field， the results showed that the sensitivity of RT-LAMP method was consistent with the nested RT-PCR method， as well as the detection result of RT-LAMP method could be easily determinate，andthe detection time was short， which can be completed within 2 hours. The RT-LAMP assay developed in this article wasvery suitable for rapid diagnosis of early NNV infection of seven-band grouper larvae in fish farming field.

Key words： seven-band grouper （Epinephelus septemfasciatus）； nervous necrosis virus （ NNV）； detection； reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification （RT-LAMP）

七带石斑鱼（Epinephelus septemfasciatus Thunberg，1793）是我国沿海分布纬度最高的石斑鱼种类，除了具有个体大、生长速度快和经济价值高等特点外，对低温的耐受能力较强，生存水温9～34 ℃，摄食水温12～32 ℃，有“冷水石斑”之称，被认为是东北亚温带海域网箱养殖理想海水鱼类品种之一[1]，其苗种繁育技术的突破，可以缓解我国东海北部和黄渤海沿岸网箱适养鱼类品种缺乏的问题，因此备受业界重视。但是尽管国内外研究多年，七带石斑鱼的苗种繁育技术始终不能稳定，在所面临的技术瓶颈中，神经坏死病毒（nervous necrosis virus，NNV）造成的早期苗种死亡率居高不下是目前最亟待解决的关键问题。……