关炜　郭娜　尚芳（山西省中医药研究院，山西　太原　030012）



腹针对慢性阻塞性肺疾病呼吸肌疲劳模型大鼠作用研究*

关炜郭娜尚芳
（山西省中医药研究院，山西太原030012）

【摘要】目的通过腹针治疗慢性阻塞性肺疾病（COPD）呼吸肌疲劳的动物实验研究，明确腹针治疗COPD呼吸肌疲劳的治疗作用，为进一步推广该诊疗技术提供动物实验证据。方法SD大鼠30只随机数字表随机分为对照组、模型组、腹针组3组，每组10只。烟熏联合气道内注射脂多糖法建立COPD大鼠模型。连续治疗30 d后测定COPD大鼠血清和膈肌组织中的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、线粒体中还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶（NOX）、琥珀酸脱氢酶（SDH）、细胞色素氧化酶（CCO）的活性。观察对照组、模型组、腹针组大鼠肺组织病理形态学的改变。结果模型组大鼠精神不振，活动及食量明显减少、眯眼、扎堆、反应迟钝、食少、体质量减轻、皮毛稀疏、灰黄无光泽有严重脱落、咳喘、呼吸道分泌物增加；正常组大鼠饮食正常、精神好，毛发光泽，反应灵敏，体质量正常。模型组大鼠体质量低于对照组（P＜0.05），针刺组大鼠体质量均高于模型组（P＜0.05）。模型组TNF-α含量高于空白对照组（均P＜0.05），腹针组TNF-α含量均低于模型组（均P＜0.05）。与对照组比较，模型组大鼠膈肌NOX、SDH、CCO组织线粒体中活性降低（均P＜0.05）；与模型组比较，腹针组NOX、SDH、CCO活性均升高（均P＜0.05）。大鼠肺组织病理形态学观察，模型组支气管黏膜上皮变性、坏死、脱落，支气管壁出现炎性充血、水肿，有大量的炎性细胞浸润，支气管内有大量粘液性炎性渗出物。腹针组炎性充血、水肿，炎性细胞浸润显著减轻。结论腹针可能是通过减少TNF-α炎性介质释放，提升COPD模型大鼠膈肌线粒体NOX、SDH、CCO活性，从而减轻COPD病理表现，进一步实现改善COPD呼吸肌疲劳、延缓COPD的进程的功能。

【关键词】慢性阻塞性肺疾病呼吸肌疲劳腹针

慢性阻塞性肺疾病（COPD）严重影响患者的劳动能力和生活质量。预计中国在未来的半个世纪将会每年有150万人死于COPD，到2020年COPD将成为全球第5位影响生存时间和生活质量的疾病［1］。呼吸肌疲劳在COPD的发展过程中十分常见，呼吸泵功能衰竭是患者呼吸衰竭的重要原因，也是COPD患者反复入院及致残、致死的重要因素。研究发现反复性气道炎症是造成COPD患者气道重构及进行性气道阻塞的主要原因［2］，其强调了本病的炎症特征，而TNF-α作为重要炎性介质，越来越受到重视。腹针疗法通过刺激患者腹部穴位治疗全身急慢性疾病及疑难疾病的针灸疗法，具有“安全、无痛、高效、快捷”等优点［3］。孙晶等［3］研究指出针刺治疗可抑制炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达，降低组织或血清中其蛋白的含量，从而减少炎性介质的分泌，缓解COPD发病进程。本实验应用腹针疗法观察对COPD呼吸肌疲劳模型大鼠的影响，通过ELISA法检测大鼠血清TNF-α含量，膈肌组织线粒体混悬液中还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶（NOX）、琥珀酸脱氢酶（SDH）、细胞色素氧化酶（CCO）活性，为进一步明确该疗法在COPD呼吸肌疲劳中的治疗作用提供证据。现报告如下。

1　材料与方法

1.1实验动物SD大鼠30只，雄性，体质量180～220 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号:SCXK（京）2014-0004。饲养环境平均温度24℃，平均湿度36%，10～15次/h全新风，光照12 h明12 h暗，自由饮水进食。

1.2试剂大鼠TNF-αELISA试剂盒，购自武汉博士德生物科技有限公司；大鼠NOX、SDH、CCO ELISA试剂盒购自上海一研生物科技有限公司。大肠杆菌脂多糖:Sigma公司（NO.L8880）。

1.3仪器AT-858型自动酶标分析仪（上海）；F325旋转石蜡切片机（英国）；TKY-BMB组织包埋机（湖北）；Excelsior全自动组织脱水机（英国Shandon）；Olympus显微镜（日本）等。

1.4分组与造模大鼠适应性饲养1周后，按随机数字表法随机分对照组、模型组、腹针组，每组10只。模型组和针刺组采用烟熏合并脂多糖气管内注射复制COPD呼吸肌疲劳大鼠模型［5］。对照组不烟熏，气管内注射等体积生理盐水。

1.5针刺方法腹针组每日基础治疗（如吸氧）＋针刺中脘、下脘、气海、关元，滑肉门（双侧），气穴（双侧）。模型组和对照组给予基础干预（如吸氧），共30 d，每周检测1次各组大鼠体质量。

1.6标本采集与检测末次针刺后，各组大鼠禁食6 h，大鼠固定于鼠台，腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg将大鼠麻醉，心脏取血，取5 mL置于离心管中，静置1 h后用一细长的针头沿试管壁剥离血块，然后3000 r/min离心10 min，取上清液，制备血清，-20℃保存。取右侧膈肌，加分离介质，制备组织匀浆，梯度离心提取组织线粒体，制成线粒体悬液［6］。血清和膈肌组织匀浆中TNF-α含量的检测采用ELISA法；ELISA法检测线粒体悬液中NOX、SDH、CCO的活性，均按照试剂盒说明书进行操作。分离肺组织，4%多聚甲醛固定，进行病理学观察。观察大鼠肺组织颜色、体积、弹性、渗出情况；右肺下叶常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、HE染色，光镜下观察肺组织病理形态变化。病理学观察由笔者所在医院病理科完成。

1.7统计学处理采用SPSS16.0统计学软件。计量资料以表示，如符合正态分布、方差齐，则采用t检验，不符合正态分布，则采用秩和检验。计数资料以频数（构成比）描述，采用X2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1一般情况观察模型组大鼠精神不振，活动及食量明显减少、眯眼、扎堆、反应迟钝、食少、体质量减轻、皮毛稀疏、灰黄无光泽有严重脱落、咳喘、呼吸道分泌物增加；正常组大鼠饮食正常、精神好，毛发光泽，反应灵敏，体质量正常。腹针组大鼠精神转好，饮食增加，毛发明显恢复光泽，反应明显较前灵敏，体质量恢复正常。

2.2各组大鼠体质量比较见表1。结果示，模型组大鼠体质量低于对照组（P＜0.05），腹针组大鼠体质量均高于模型组（P＜0.05）。

表1　各组大鼠不同时间体质量比较

表1　各组大鼠不同时间体质量比较

与模型组比较，*P＜0.05；与对照组比较，△P＜0.05。下同。

组别　n腹针组　10对照组　10模型组　10 1周　2周　3周　4周334.43±15.89 350.80±17.71*372.09±19.56*400.45±23.91*393.74±20.21 421.80±22.25　435.56±25.34 457.14±33.52 329.01±16.74△337.91±10.12△358.67±15.22△370.57±19.40△

2.3各组大鼠血清和膈肌组织中TNF-α含量比较见表2。结果示，模型组TNF-α含量高于对照组（均P＜0.05），腹针组TNF-α含量均低于模型组（均P＜0.05）。

表2　各组大鼠血清和膈肌组织中TNF-α含量比较（pg/mL，

表2　各组大鼠血清和膈肌组织中TNF-α含量比较（pg/mL，

组　别　n　血清TNF-α　膈肌组织中TNF-α对照组　10　107.61±25.44　39.43±6.12模型组　10　243.41±45.12△　58.29±8.26△腹针组　10　184.90±45.74*　46.64±8.31*

2.4各组大鼠线粒体悬液中NOX、SDH、CCO活性比较见表3。与对照组比较，模型组大鼠膈肌NOX、SDH、CCO组织线粒体中活性降低（均P＜0.05）；与模型组比较，腹针组NOX、SDH、CCO活性均升高（均P＜0.05）。

表3　各组大鼠线粒体悬液中NOX、SDH、CCO活性比较（U/L，

表3　各组大鼠线粒体悬液中NOX、SDH、CCO活性比较（U/L，

组别　n　NOX对照组　10　31.64±5.89模型组　10　17.41±3.29△腹针组　10　23.64±4.62*SDH　CCO 25.80±6.09　9.90±3.43 15.89±5.53△　7.81±2.94 20.26±6.38*　8.53±3.26*

2.5各组大鼠肺组织病理形态学观察比较见图1。模型组:支气管黏膜上皮变性、坏死、脱落，支气管壁出现炎性充血、水肿，有大量的炎性细胞浸润，支气管内有大量黏液性炎性渗出物。腹针组:炎性充血、水肿，炎性细胞浸润显著减轻。

3　讨论

本研究拟通过腹针治疗COPD急性加重期呼吸肌疲劳的动物实验研究，明确腹针对COPD呼吸肌疲劳的治疗作用。由于人类COPD的主要原因是吸烟和慢性反复感染［7］，因此本实验动物模型采用烟熏合并脂多糖气管内注射复制COPD呼吸肌疲劳大鼠模型。该模型与人类COPD的发生情况相似从而更接近人类的COPD病理变化与形成过程。烟雾中的多种成分直接或间接导致气道炎症、肺组织破坏、气道阻塞、免疫功能受抑以及促进致病微生物在下呼吸道定植等［8］。脂多糖是革兰阴性菌的细胞壁成分，作为内毒素在病菌对机体的致病性方面起着重要作用。它可刺激单核巨噬细胞、上皮细胞及中性粒细胞等合成释放一系列前炎症因子和炎症因子如TNF-α，介导气道和肺组织的炎症反应［9］。COPD患者无论在轻中重度，均有不同程度的膈肌功能下降，由于膈肌在呼吸过程中所起的作用占全部呼吸做功的80%，所以呼吸肌疲劳主要是膈肌疲劳。因此COPD大鼠模型同样适用于COPD呼吸机疲劳大鼠模型。

图1　各组大鼠肺组织病理形态学观察比较（HE染色，20倍）

中医学并没有与COPD相对应的病名，根据其临床表现，可将其归为“肺胀”“喘证”等范畴。有研究［10］对近20年有关COPD的现代文献统计分析后，结果表明COPD的病位在肺、脾、肾3脏。标实为痰浊、水饮、瘀血和气滞，痰有寒化与热化之分；本虚为肺、脾、肾气虚，晚期则气虚及阳，或阴阳两虚。其基本病机是肺之体用俱损，呼吸机能错乱，气壅于胸，滞留于肺，痰瘀阻结肺管气道，导致肺体胀满，张缩无力，而成肺胀究其本质与肺脾关系最为密切。“肺主气，司呼吸”，具有调节全身气机，推动血液运行的作用，肺气宣降不利，升降失常，则产生咳喘之症，久则肺气虚损。“肺朝百脉，主治节”，是血液进行气体交换的场所，肺虚治节失职，则循环不利，血行涩滞，肺气郁滞更甚，造成气滞血瘀。脾胃属土，脾为后天之本，万物皆生化于脾土，久患肺病及母，脾气亦亏，脾虚则水湿不化，聚而为痰，痰湿阻肺，郁而化热，肺气壅遏不畅，咳喘遂生，此即“脾为生痰之源，肺为贮痰之器”。脾气虚也是呼吸肌疲劳发生的一个重要病理因素，由于“脾主肌肉”人体肌肉功能与脾胃的运化相关，脾胃为后天之本，化生气血，供养肌肉。脾气盛则运化水谷和转输精微功能正常，肌肉可以很好得以濡养。脾气虚弱，吸收运化水谷的功能降低，气血精微物质生成不足，则导致肌肉失养，终致肌肉瘦削、软弱无力，甚至萎弱不用。由此可见，脾肺气虚，呼吸肌失养，则容易出现呼吸肌疲劳，而表现为喘促、气急，遇劳加剧等症。腹针疗法是薄智云教授经过20多年的研究创建的一种通过针刺腹部穴位调节先天、后天经络，治疗慢性病、疑难病的新疗法［11］。此疗法以神阙系统为核心，对全身系统进行宏观调控。其选穴分为主穴、辅穴、佐穴、使穴四部（即君、臣、佐、使）。主穴是根据病情的需要，针对病因和主要症状进行脏腑辨证，以集中解决疾病的主要矛盾；辅穴是加强主穴调理脏腑的功效或兼顾调理其他相关脏腑症状的穴位；佐穴协助主穴和辅穴调整内脏后，进行经络辨证，调理相关经脉或相表里经脉，治疗一些次要症状；使穴为治疗相关症状的穴位，具有引导气血直达病所的作用，是治疗疾病临床症状的相应部位局部取穴，也有调和诸穴的作用［12］。任何的穴位都是一个已知的定位点而决不是任意点［13］。本实验选取中脘穴、下脘穴作为主穴健脾和胃、降逆止呕；气海穴、关元穴配合培补元气，为辅穴；滑肉门穴为足阳明脉气所发，具有调中气、和肠胃、理气滞的作用，此穴为“腹四关”之二，与以上穴位合用有通腑之妙，促进血液循环，为佐穴［14］；气穴位于脐中下3寸，旁开0.5寸，是人体足少阴肾经上的重要穴道，主要功能为补益冲任，为使穴。诸穴配合疏通经脉，可以使脾、肾的功能得到调整，恢复人体内脏的稳态。

膈肌张力、耐力的降低是发生膈肌疲劳、呼吸困难的机制，这两个因素也是COPD呼吸肌疲劳的主要危险因素。COPD患者常有不同程度的膈肌功能障碍，尤其急性加重期时膈肌疲劳显著，后者是导致呼吸衰竭的一个重要因素［15-16］。TNF-α是一种能诱导肿瘤组织出血坏死的物质，具有非常复杂的生物学活性，在免疫和非免疫系统中发挥着广泛的作用，除了抗肿瘤作用外，还参与炎症、发热以及机体脂肪、蛋白质的分解代谢等病理生理过程［17］。研究已证实其在COPD患者血液、痰液、支气管肺泡灌洗液及肺组织中是升高的，且与COPD患者的静息能量消耗增加，恶液质形成和预后不良有关［18］。而重症肌无力患者早期TNF-α可显著升高，并存在细胞免疫功能紊乱［19］。线粒体是细胞呼吸和产生ATP的部位［20］。线粒体的内膜含有呼吸链和氧化磷酸化系统的全部酶包括SDH、CCO等。SDH是三羧酸循环的一个关键酶，其活性的高低及含量的多少影响着三羧酸循环的速度，三羧酸循环是机体长时间运动时产生能量的最重要的途径。CCO是呼吸链中的关键酶，其活性的高低及含量的多少直接影响着呼吸链传递电子的效率［21］。NADH氧化酶通常简写为NOX，位于细胞外膜，在糖酵解、三羧酸循环和线粒体呼吸链中的氧化还原反应都离不开它的参与，主要为能量的存储和释放提供必要的准备。以上3项指标都可直接反应膈肌功能。本实验结果表明模型组TNF-α含量高于对照组，腹针组TNF-α含量低于模型组，模型组NOX、SDH、CCO的活性均低于对照组，腹针组NOX、SDH、CCO的活性均高于模型组；病理结果显示腹针组可减轻慢性支气管炎模型大鼠支气管黏膜层和黏膜下层炎性细胞的浸润、减轻黏膜上皮细胞的坏死和脱落，减少气道分泌物。结果示，腹针治疗可以减少炎症介质释放，减轻炎症反应，使NOX、SDH、CCO含量升高，提高呼吸链功能酶活性，有利于膈肌呼吸功能恢复，表明腹针可以改善COPD引起的膈肌疲劳，减缓COPD进程。

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·证治探讨·

·薪火传承·

Effect of Abdominal Acupuncture on the Respiratory Muscle Fatigue Model with Chronic Obstructive Pulmonary Disease

GUAN Wei，GUO Na，SHANG Fang.Shanxi Institute of Chinese Medicine，Shanxi，Taiyuan 030012，China.

【Abstract】Objective: To study the animal experiments abdominal acupuncture on the respiratory muscle fatigue model of chronic obstructive pulmonary diseases（COPD），clarify its clinical effects，and provide evidence for the further promotion of the treatment technology.Methods: 30 SD rats，weighing 180 g to 220 g were adaptively fed for one week，and then，according to a random number table，were randomly divided into three groups，namely the control group，the model group，abdominal acupuncture group（n = 10）.Smoked joint intratracheal injection of lipopolysaccharide was used to make rat model COPD.After continuous treatment for 30 days，serum and tissues of diaphragm in COPD rat tumor necrosis factor-α（TNF-α），mitochondria reduced nicotinamide adenine dinucleotide nucleotide oxidase（NOX），succinate dehydrogenase（SDH），cytochrome oxidase（CCO）activity were detected.Pathological changes of lung tissues in rats of the three group were observed.Results: 1）The serum and the contents of TNF-α in diaphragm in rats in other two groups were higher than those in the control group（P＜0.05）and TNF-α content in abdominal acupuncture group increased significantly lower than that of the model group（P＜0.05）.2）The activity of NOX，SDH，CCO in diaphragm mitochondria in the model group and abdominal acupuncture group was significantly lower than that of the control group（P＜0.05）；the activity of NOX，SDH，CCO in diaphragm mitochondria in abdominal acupuncture group reduced less than that of the model group（P＜0.05）；3）Lung pathology showed: the model group: bronchial epithelial degeneration，necrosis，inflammation of the bronchial wall occurs congestion，edema，a large number of inflammatory cell infiltration，There were a lot of mu-cus bronchial inflammatory exudate；abdominal acupuncture group: significant reduce of bronchial mucosa and submucosa infiltration of inflammatory cells，mucosal epithelial cells necrosis and shedding，and airway secretions.Conclusion: There exists serum and TNF-α in diaphragm tissues increasing in COPD rat model with respiratory muscle fatigue.The activity of NOX，SDH，CCO in diaphragm mitochondria decrease.pathology appears bronchial epithelial degeneration，necrosis，inflammation of the bronchial wall occurs congestion，edema，a large number of inflammatory cell infiltration，and there is a lot of mucus performance inflammatory exudate within bronchial.After abdominal acupuncture intervention，the above situation can be significantly altered.The needle reduces the pathology of COPD probably by reducing TNF-α inflammation media release and upgrading activity of NOX，SDH，CCO in COPD diaphragm mitochondria，and thereby，COPD further realizing the improvement of respiratory muscle fatigue，delaying the process function of COPD，providing reliable Animal experimental evidence to abdominal acupuncture on COPD respiratory muscle fatigue.

【Key words】COPD；Respiratory muscle fatigue；Abdominal acupuncture

中图分类号:R285.5

文献标志码:A

文章编号:1004-745X（2016）01-0068-05

doi:10.3969/j.issn.1004-745X.2016.01.023

*基金项目：山西省科技厅青年课题（2013021037-2）

收稿日期（2015-09-22）