陈红兵　刘一民　赵磊（山东省潍坊市益都中心医院，山东　潍坊　262500）



胡黄连苷Ⅱ对大鼠脑缺血再灌流损伤的保护作用及对AQP4、MMP-9表达的影响*

陈红兵△刘一民赵磊
（山东省潍坊市益都中心医院，山东潍坊262500）

【摘要】目的观察胡黄连苷Ⅱ对大鼠脑缺血再灌流损伤的保护作用及对AQP4、MMP-9表达的影响。方法选取120只成年健康雄性大鼠，随机选择30只作为假手术组，其余90只制备脑缺血再灌注模型，成功78只，平均分为模型组和胡黄连苷Ⅱ组。胡黄连苷Ⅱ组给予胡黄连苷Ⅱ腹腔注射，模型组、假手术组给予等量的生理盐水腹腔注射，假手术组不制备脑缺血模型，其他步骤均同模型组。检测3组大鼠神经功能缺失评分、DCI、ACI、CIV，以及水通道蛋白4（AQP4）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）和环氧合酶2（COX2）表达水平。结果

胡黄连苷Ⅱ组神经功能缺失评分、DCI、ACI、CIV水平较假手术组显著降低，模型组各水平也较假手术组明显降低，且胡黄连苷Ⅱ组较模型组也明显降低；胡黄连苷Ⅱ组的AQP4、MMP-9和COX2表达水平分别为（1.12±0.14）、（0.95±0.08）、（0.58±0.05）ng/mL，较模型组明显降低，较假手术组显著升高，差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。结论胡黄连苷Ⅱ可以显著抑制AQP4、MMP-9表达，对脑缺血再灌流损伤具有一定的保护作用。

【关键词】胡黄连苷Ⅱ脑缺血再灌流水通道蛋白4基质金属蛋白酶9

中脑缺血性损伤可以引发缺血半暗带区域神经细胞的凋亡。研究证实［1-2］，脑缺血损伤和脑组织处在低氧环境中，导致神经细胞坏死或凋亡，而细胞外信号调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）通路在脑缺血造成损伤的过程中，具有促炎症反应，介导神经细胞凋亡的作用。ERK1/2通路抑制剂以及钙通道阻滞剂氯胺酮能够抑制脑缺血动物模型中ERK1/2通路被激活，并下调miRNA-21和基质金属蛋白酶9（MMP-9）的表达。水通道蛋白4 （AQP4）参与介导水分子的跨膜转运，当脑缺血持续3 h，梗死周围皮质区的AQP4水平明显升高，而胡黄连苷Ⅱ可以下调其表达水平［3］，同时还可以抑制MMP-9的表达，缓解炎症性损伤，减轻脑缺血再灌流损伤。本研究旨在进一步探讨胡黄连苷Ⅱ对大鼠脑缺血再灌流损伤的保护作用及对AQP4、MMP-9表达的影响，采用对照方法进行实验。现报告如下。

1　材料与方法

1.1实验动物选取120只成年健康雄性大鼠，体质量230～250 g，平均（246.8±2.5）g，均由药物检验所实验动物中心提供。

1.2分组与造模随机选择30只作为假手术组，其余90只大鼠禁食12 h后，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，剂量为0.3 mL/kg，仰卧固定，分离结扎双侧颈总动脉建立脑缺血模型。术中以及术后保持肛温36～37℃，术后2 h，若大鼠仍苏醒或者死亡，则剔除。剔除12只，剩余78只随机分为模型组和胡黄连苷Ⅱ组，各39只。假手术组不进行双侧颈总动脉结扎，其余操作均同上。

1.3给药方法胡黄连苷Ⅱ组在脑缺血2 h后，将胡黄连苷Ⅱ（购自天津奎青有限公司，分子量为512，纯度＞98%，使用生理盐水稀释至浓度为10 g/L）腹腔注射，剂量为20 mg/kg。假手术组和模型组腹腔注射生理盐水，剂量为20 mg/kg。注意:此操作需要同一研究小组在同一时间协调完成。

1.4标本采集与检测1）DCI测定。治疗后24 h，每组选取5只大鼠，经心脏灌注200 mL 4%多聚甲醛溶液后取脑，切取缺血部位的脑组织放入4%多聚甲醛溶液中固定2 h，蒸馏水浸泡4 h，常规脱水、透明以及包埋，连续冠状切片，厚度5 μm，然后将其贴在防脱载玻片上，4℃保存。对于石蜡切片常规脱蜡水化，并用苏木精染色5 min，浓度为1%的盐酸酒精分色20 s，浓度为1%的氨水返蓝30 s，然后伊红染色5 min，并使用乙醇梯度脱水，二甲苯透明处理，中性树胶封片。在400倍显微镜下，随机选取4个皮质区不重叠的视野进行观察，DCI=变性细胞数/细胞总数，用以表示皮质区损伤程度。2）ACI测定。对石蜡切片常规脱蜡水化，并严格按照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（购自凯基生物公司）使用说明书进行操作。然后在光学显微镜下观察，细胞核中发现棕色颗粒的为凋亡细胞，在400倍显微镜下，随机选取4个皮质区不重叠的视野进行观察，ACI=凋亡细胞数/细胞总数，用以表示细胞凋亡的程度。3）CIV测定。于治疗24 h后，从每组随机选取5只大鼠，并经心脏灌注200 mL生理盐水取脑，做连续冠状切片，厚度为2 mm，置于20 g/L的氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲液中浸泡10 min，并于37℃避光保存。正常脑组织呈现均匀红色，而梗死组织呈现白色。应用计算机软件Photoshop CS测得经过视交叉平面的脑梗死面积和该层同侧半球面积，而CIV=脑梗死面积/同侧半球面积，用以表明脑梗死体积。4）AQP4、MMP-9、环氧合酶2（COX2）水平检测。采用酶联免疫吸附法，取包被有抗三者特异性抗体的酶标板，然后按照标本的次序分别加入标准品溶液50 μL于空白微孔中，并加入样品50 μL，空白孔加入蒸馏水50 μL，其余各孔加入酶标记物溶液100 μL，封口胶密封，并于37℃温育1 h，使用洗涤液充分洗涤3次，然后用吸水纸拍干；除假手术组外，其余每孔加入显色剂A、B液均50 μL，于37℃暗处温育15 min；分别加入终止液50 μL，于30 min内采用酶标仪在450 nm处测定OD值，然后依据OD值在标准曲线上找到其对应质量浓度（ng/mL）。

1.5神经功能缺失评分分别于治疗前和治疗后24 h采用mNSS方法进行判定［4］，总分为0～18分，分值越高表明神经功能损伤越严重。

1.6统计学处理采用SPSS13.0统计软件处理。计量资料以表示，计数资料用百分率（%）表示，用检验，用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠神经功能缺失评分见表1。假手术组大鼠活动正常，模型组和胡黄连苷Ⅱ组大鼠均表现出不同程度的神经行为功能障碍和缺失。再灌注治疗前后自身比较，治疗后胡黄连苷Ⅱ组神经功能缺失评分较治疗前明显降低（P＜0.05），而模型组神经功能缺失评分较治疗前明显升高（P＜0.05），治疗后，胡黄连苷Ⅱ组神经功能缺失评分较模型组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1　各组大鼠再灌注治疗前后神经功能缺失评分比较

表1　各组大鼠再灌注治疗前后神经功能缺失评分比较

与本组治疗前比较，*P＜0.05；与假手术组治疗后比较，#P＜0.05；与模型组治疗后比较，△P＜0.05。

组别　n　治疗前　治疗后假手术组　30　0.32±0.02　0.35±0.03模型组　39　10.01±1.32　10.76±1.45*胡黄连苷Ⅱ组　39　9.98±1.28　7.92±1.36*#△

2.2各组大鼠DCI、ACI、CIV水平比较见表2。模型组DCI、ACI和CIV水平较假手术组均明显升高，而胡黄连苷Ⅱ组3者水平较假手术组均明显升高，较模型组均明显降低，差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。

2.3各组大鼠AQP4、MMP-9和COX2表达水平比较见表3。模型组AQP4、MMP-9和COX2表达水平较假手术组均明显升高，而胡黄连苷Ⅱ组3者水平较假手术组均明显升高，较模型组均明显降低，差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。

表2　各组大鼠DCI、ACI、CIV水平比较

表2　各组大鼠DCI、ACI、CIV水平比较

与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。下同。

组别　n　DCI假手术组　30　0.02±0.01模型组　39　0.72±0.06*胡黄连苷Ⅱ组　39　0.38±0.04*△ACI　CIV 0.09±0.02　4.32±0.12 0.68±0.05*　78.96±5.34*0.32±0.03*△62.38±4.95*△

表3　各组大鼠AQP4、MMP-9和COX2表达水平比较

表3　各组大鼠AQP4、MMP-9和COX2表达水平比较

组别　n　AQP4假手术组　30　0.59±0.06模型组　39　1.68±0.13*胡黄连苷Ⅱ组　39　1.12±0.14*△MMP-9　COX2 0.43±0.03　0.24±0.02 1.32±0.09*　0.96±0.06*0.95±0.08*△　0.58±0.05*△

3　讨论

脑缺血性损伤包括缺血期原发性损伤以及再灌流期继发性损伤，后者成为脑缺血再灌流损伤，可以在多种脑血管疾病中并发，是多环节、多途径、多因素损伤酶联促级反应［5］。脑缺血发生后，导致各种炎症因子表达水平升高，引发血脑屏障完整性损害，通透性增加，加重脑水肿的严重程度。水通道蛋白是一种与跨膜水转运动相关的，具有四聚体结构的膜通道蛋白［6-7］，其中APQ4分布于中枢神经系统中，是主要的水特异性通道蛋白，调节水通道活性。该物质主要分布于脊髓组织和脑组织中的室管膜细胞和星形胶质细胞的细胞膜上。研究表明［8］，APQ4对急性脑缺血大鼠具有指示作用。在正常的脑组织中，MMP-9表达水平较低，发生脑缺血时，各种细胞因子和炎性介质被释放，活化的MMP-9对基底膜造成损坏，导致血脑屏障受损［9］，最终形成继发性缺血后脑水肿。因此，可以将MMP-9表达水平作为评估脑缺血损伤严重程度的一项重要指标。COX是核因子信号转导的靶目标之一，在正常的情况下，仅在神经元等少数细胞中低水平表达，当脑缺血造成损伤后，其表达水平明显增强，是神经损伤治疗的公认重要靶点［10］。本研究中，模型组大鼠的AQP4、MMP-9和COX2的水平较假手术组明显升高，胡黄连苷Ⅱ组的AQP4、MMP-9和COX2水平也较假手术组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），表明脑缺血再灌流对机体造成明显的损伤，与理论基础相符合。

中医学认为，由脑缺血再灌流损伤引发的脑病属于“中风”的范畴［11］。中医理论认为该病的病机主要为气虚不能摄血，气滞血瘀等。中医药对APQ4表达调节作用显著，能够多层次、多靶点、多环节发挥其优势［12］，因此采用中药减轻脑缺血再灌流损伤及其作用机制已逐渐成为研究领域的热点。现代药理研究证实［13-14］，胡黄连具有清热、燥湿、凉血的作用，且其主要成分为胡黄连苷Ⅱ，能够抗氧化、清除自由基，并通过抑制APQ4和MMP-9蛋白表达水平，对TLR4-NFKB信号起阻断作用，进而缓解脑水肿严重程度，改善大脑神经功能。本研究中，是胡黄连苷Ⅱ组DCI、ACI、CIV、AQP4、MMP-9和COX2水平较模型组明显降低，表明胡黄连苷Ⅱ可以保护大鼠脑缺血再灌流损伤，并抑制AQP4、MMP-9和COX2蛋白的表达。

综上所述，胡黄连苷Ⅱ对脑缺血再灌流大鼠损伤具有一定的保护作用，能够显著抑制AQP4、MMP-9和COX2蛋白的表达，减少梗死面积和脑组织皮质区细胞凋亡程度，并减轻脑损伤。

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Protective Effect of Picroside II on Cerebral Ischemia Reperfusion Injury in Rats and the Expression of MMP-9 and AQP4

CHEN Hongbing，LIU Yimin，ZHAO Lei.Yidu Central Hospital of Weifang，Shandong，Weifang 262500，China.

【Abstract】Objective: To explore and study the protective effect of picroside II on cerebral ischemia reperfusion injury in rats and the expression of MMP-9 and AQP4.Methods: 30 rats were randomly selected from 120 adult healthy male ones as normal control group，the remaining 90 of preparing cerebral ischemia reperfusion model.78 successful rats were divided into the observation group and the solvent group.The observation group received picroside II by intraperitoneal injection，while the solvent control group were given the same amount of saline by intraperitoneal injection，and the normal control group were not prepared for the rat model of focal cerebral ischemia，but other steps were the same as the solvent group.The neurological function score，DCI，CIV，ACI，AQP4，MMP-9 and COX2 expression in the three groups were observed and compared.Results: In the observation group，neurological deficit score，DCI，ACI，CIV levels decreased significantly compared with the normal control group，and each level of the solvent group were lower than those in the normal control group，and the data of the observation group compared with those of the solvent group decreased significantly.AQP4，MMP-9 and COX2 expression level of the observation group were respectively（1.12±0.14），（0.95±0.08），（0.58±0.05）ng/mL，compared with the solven group，decreasing obviously，and compared with the normal control group，increasing significantly.Differences were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion: Picroside II can inhibit the expression of AQP4 and MMP-9，which has protective effects on cerebral ischemia reperfusion injury.

【Key words】Picroside II；Cerebral ischemia reperfusion；Aquaporin 4；Matrix metalloproteinases 9

中图分类号:R285.5

文献标志码:A

文章编号:1004-745X（2016）01-0060-04

doi:10.3969/j.issn.1004-745X.2016.01.021

*基金项目：山东省潍坊市卫生局科研项目计划（2014007）

通信作者△（电子邮箱：chb0536@aliyun.com）

收稿日期（2015-10-09）