白建民　时伟峰　时伟红　郭万周　高菲　苏方静（.南阳医学高等专科学校，河南　南阳　473000；.南阳医学高等专科学校第一附属医院，河南　南阳　473000）



术砂豆仁汤对UC模型大鼠血清IL-6、IL-10、TNF-α水平的影响*

白建民1△时伟峰2时伟红1郭万周1高菲1苏方静1
（1.南阳医学高等专科学校，河南南阳473000；2.南阳医学高等专科学校第一附属医院，河南南阳473000）

【摘要】目的观察术砂豆仁汤对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠的血清白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10 （IL-10）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平的影响。方法健康SD雄性大鼠40只，随机分为4组，即正常组、模型组、SASP组、术砂豆仁汤组。采用5%的2、4、6-三硝基苯磺酸（TNBS）125 mg/kg乙醇灌肠法建立溃疡性结肠炎大鼠模型，光镜观察大鼠结肠组织病理形态并评分，用酶联免疫吸附法测定大鼠血清IL-6、IL-10、TNF-α水平。结果模型组大鼠血清IL-6、TNF-α含量均高于正常组（均P＜0.01），而IL-10含量低于正常组（P＜0.01）；术砂豆仁汤组血清IL-6、TNF-α水平均较模型组降低（P＜0.01），IL-6含量则显著升高（P＜0.01）。结论术砂豆仁汤可降低血清IL-6、TNF-α含量，提高IL-10含量，这可能是其治疗UC作用机理之一。

【关键词】溃疡性结肠炎术砂豆仁汤TNF-α IL-10 IL-6

溃疡性结肠炎（UC）是一种肠道非特异性炎症性疾病，其病因及发病机制尚不明确，该病缠绵愈，易复发，被世界卫生组织（WHO）列为现代难治病之一。中医学认为本病以脾肾阳虚为本，湿邪阻滞为标。“脾虚湿胜、肾阳虚损”为本病的根本病机，而术砂豆仁汤具有健脾化湿、温阳止泻之功。本研究通过观察术砂豆仁汤对三硝基苯磺酸乙醇溶液诱导的UC模型大鼠结肠组织形态学及血清白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量的影响，从而评价术砂豆仁汤治疗UC的疗效及作用机制，为其临床应用及开发提供实验依据。

1　材料与方法

1.1实验动物清洁级健康雄性SD大鼠，鼠龄3～4个月，体质量（200±20）g，共60只，由南阳实验动物中心提供。

1.2试药与仪器术砂豆仁汤:白术20 g，苍术20 g，蚕砂10 g，益智仁15 g，薏苡仁15 g，炒扁豆15 g，甘草4 g组成（以上药材购自南阳医专附属中医院中药房，经南阳医学高等专科学校药学系中药鉴定教研室姚学文副教授鉴定，符合2010版《中国药典》相关规定）。水煮法（按上处方称取药，水煎煮2次，第1次加10倍量水煎煮60 min，第2次加8倍量水煎煮40 min，合并2次滤液，制成浓缩液），浓缩至生药含量为2 g/L的溶液。KDC-220HR高速冷冻离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）；AEL-160电子分析天平（日本岛津公司）；U-2900型可见-紫外分光光度计（日本日立公司）；XK96-A/B型快速混匀器（姜堰市新康医疗器械有限公司）；酶标仪控制及管理系统（郑州安图生物工程有限公司）。5%2，4，6-三硝基苯磺酸（Simga-Aldrich Chemical Co.）；柳氮磺胺吡啶（SASP，上海三维制药有限公司）；大鼠白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.3分组与造模60只SD大鼠适应性饲养1周后，随机抽取10只作为正常组。其余大鼠禁食24 h后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，将长12 cm，直径2 mm的乳胶灌肠管由肛门缓缓插入结肠约8 cm，将0.5 mL灌肠液（含20 mg TNBS的30%乙醇）缓缓注入结肠后，提起大鼠尾部，倒置30 s，捏紧肛门，平躺5 min，自然清醒，常规饲养。造模1周后（大鼠出现腹泻、黏液脓血便后，随机抽取实验大鼠3只剖腹截取直肠和结肠，肉眼观察结肠黏膜充血水肿情况，确定造模成功）将模型动物随机分为3组，即模型组、SASP组（0.3 mg/kg）、术砂豆仁汤组，每组10只。持续灌胃给药5周，术砂豆仁汤组给予术砂豆仁汤（含生药量20 mg/kg）；SASP组给予SASP（0.3 mg/kg），正常组和模型组给予等量0.9%氯化钠溶液。

1.4观察指标每天定时观察各组大鼠精神状况、进食、活动、大便等变化，并记录。末次给药24 h内，禁食不禁水，脱颈椎法处死大鼠，取全血标本4～5 mL于干燥试管中，离心机以4000 r/min离心10 min，取血清，置于-20℃冰箱内冻存，即为待测标本。立即剖腹，分离结肠，自肛门2 cm处向上取结肠6～8 cm，沿肠系膜缘剪开肠腔，用4℃0.9%氯化钠溶液冲洗干净，将肠黏膜层向上平铺并固定于观察台，立即进行肉眼结肠大体形态损伤评分［1］。取结肠中病变最严重处，取一部分用4%多聚甲醛固定样本，常规石蜡包埋，连续切片（4 μm），常规HE染色，光镜下观察组织病理学改变。血清IL-6、IL-10、TNF-ɑ水平检测:待测标本，放于4℃冰箱内自然解冻，严格按照ELISA试剂盒说明测定大鼠血清IL-6、IL-10、TNF-ɑ含量。

1.5统计学方法采用SPSS15.0统计软件分析。计量资料以表示，组间差异的显著性检验运用软件提供的非参数检验和单因素方差分析方法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠一般情况比较见表1。正常组大鼠神态安逸，背毛光亮，活动敏捷，饮食量大，大便呈颗粒状，肛周清洁。造模成功后，模型大鼠均出现精神萎靡，嗜卧扎堆，背毛竖起无光泽，食量减少，体质量下降，稀便、血便或隐血试验阳性等表现。治疗后，术砂豆仁汤组和SPAS组症状均逐渐好转，大体评分明显高于模型组（P＜0.05或P＜0.0），与正常组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1　各组一般情况及DAI评分比较

表1　各组一般情况及DAI评分比较

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组别　n　DAI评分　大体评分术砂豆仁汤组　10　0.42±0.31**　4.82±1.13**正常组　10　0±0　0±0模型组　10　7.23±0.61△△　8.32±1.10△△SASP组　10　1.33±0.21**　5.34±1.02*

2.2各组大鼠大体形态观察和损伤评分见表1。正常组大鼠结肠壁薄而光滑，黏膜色泽淡红，皱襞清晰完整，肠壁与周围组织无黏连。模型组大鼠结肠部分黏膜充血水肿、糜烂，严重者见溃疡形成，溃疡呈白线条状或灶状，肠壁与周围组织黏连，肠腔变窄；术砂豆仁汤组、SASP组结肠大体形态均逐渐恢复正常，溃疡基本愈合，肠壁增厚或形成瘢痕，无黏连，其DAI评分明显低于模型组（P＜0.01）。

2.3各组大鼠光镜下病理改变见图1。造模后，模型大鼠结肠黏膜上皮水肿、坏死、脱落，固有层模糊，黏膜下层甚至肌层有大量炎性细胞浸润，溃疡形成，间质层有嗜中性和嗜酸性粒细胞，黏膜下层有大量结缔组织增生、其间有大量中性粒细胞等炎症细胞浸润。SASP

图1　各组结肠组织病理切片图（HE染色，200倍）

组大鼠结肠黏膜层部分恢复，溃疡灶可见大量炎性细胞，腺体间可见少量纤维结缔组织，但腺体开口大小不一致，排列不整齐，有散在的杯状细胞；上皮细胞内胞浆仍有水肿、溶酶体稍多。术砂豆仁汤组溃疡基本愈合，杯状细胞减少，结缔组织增生并纤维化。

2.4各组大鼠血清IL-6、IL-10、TNF-α水平比较见表2。与正常组相比，模型组IL-6、TNF-α含量显著升高（均P＜0.01），IL-10含量显著降低（P＜0.01）。术砂豆仁汤组能显著降低IL-6、TNF-α含量（P＜0.01），提高IL-10含量（P＜0.01），与SASP组相比，无明显差异（P＞0.05）。

表2　各组大鼠IL-6、IL-10、TNF-α水平比较

表2　各组大鼠IL-6、IL-10、TNF-α水平比较

组别　n　IL-6术砂豆仁汤组　10 123.1±14.4**正常组　10　93.4±9.1模型组　10 171.5±16.4△△SASP组　10 121.0±12.1**IL-10　TNF-α 71.3±4.8**　32.64±9.32 87.6±8.5　31.39±9.27 39.5±4.6△△　78.87±8.89 69.1±5.0**　35.36±8.29

3　讨论

UC属中医学泄泻之范畴，“脾虚湿胜，肾阳虚损”是本病病机之根本。肾为五脏之本，脾阳根于肾阳，肾为胃关，开窍于二阴，肾虚无以温煦脾阳，则脾失健运，水湿内停；反之，脾阳久虚，损及肾阳，致脾肾阳虚和而为病。据此，在《医宗必读》治泻九法的基础上，定“燥脾温肾”之法，立术砂豆仁汤为方。方中白术益气健脾，温燥寒湿；苍术为燥湿健脾之要药。苍术苦温辛烈，燥湿力胜，散多于补，偏于平胃燥湿；白术甘温性缓，健脾力强，补多于散，善于补脾益气。二药合用，则脾胃纳运如常。蚕砂具有和胃化浊，祛风除湿之功；炒扁豆健脾化湿，和中益气；薏苡仁健脾利湿而不留邪；益智仁温脾、暖肾、固气；甘草补中益气，调和诸药。诸药合用，共奏温肾健脾、和中益气、化湿止泻之功效。

现已证实，促炎细胞因子如IL-6、TNF-α是公认的能介导UC发病的细胞因子，而IL-10在维护肠道正常免疫功能中起重要作用［1-3］。IL-6主要生物作用是趋化并激活中性粒细胞，促进中性粒细胞的溶酶体活性和吞噬作用，故IL-6在炎症反应中起着直接的介导作用［4-5］。TNF-α是介导和调节免疫炎症反应的多肽分子，是目前已知的与UC发病关系最为密切的细胞因子。TNF-α可诱导NO合成酶异构体，使NO生成增多，加重细胞黏膜损伤，亦可协同干扰素γ改变肠道上皮的屏障功能，诱导肠上皮细胞的凋亡［6-8］。还可诱导凝血酶形成，减少血栓调节素释放，导致黏膜微循环障碍，加重黏膜损伤。IL-10又名细胞因子合成抑制因子，主要由单核巨噬细胞产生，是一种强有力的抗炎和免疫抑制性细胞因子。它既可抑制激活单核细胞、巨噬细胞、粒细胞，限制中性粒细胞产生；又可抑制单核/巨噬细胞产生趋化因子，抑制中性粒细胞及巨噬细胞的趋化性，减少其向炎症部位聚集。研究表明［9-10］，人IL-10能在mRNA上有效抑制活化的单核细胞产生IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性细胞因子。可见，IL-10可缓解肠黏膜炎症反应，减轻损伤组织，利于组织的重建和修复。

本研究表明，术砂豆仁汤治疗结肠炎具有潜在实用价值，但其作用机制还有待进一步研究。

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·研究报告·

·研究报告·

Effects of Zhusha Douren Tang on Serum Levels of IL-6，IL-10，TNF-α in UC Rat Model

BAI Jianmin，SHI Weifeng，SHI Weihong，et al.Nursing Department，Nanyang Medical College，Henan，Nanyang 473000，China.

【Abstract】Objective: To observe the effects of Zhusha Douren Tang on serum levels of IL-6，IL-10，TNF-α in ulcerative colitis rat model.Methods: Forty healthy Sprague-Dawley rats were randomly divided into 4 groups，namely the normal control group，the model group，SASP group and Zhusha Douren Tang group.5%2，4，6-trinitro-benzene-sulfonic acid（TNBS）125mg and ethanol enema method was used to set up ulcerative colitis rat model，the rat colon tissue pathological morphology was observed and assessed with light microscopy.Serum levels of IL-6，TNF，and IL-10 were measured by enzyme-linked immunosorbent assay.Results: The serum levels of IL-6 and TNF-α of the model group were higher than those of the normal control group（P＜0.01 or P＜0.01），but the serum level of IL-10 in the model group was lower than that in normal control group（P＜0.01）；the serum levels of IL-6 and TNF-α in the Zhusha Douren Tang group were lower than those of the model group（P＜0.05，P＜0.01）and the level of IL-6I/IL-10 increased significantly（P＜0.01）.Conclusion:Zhusha Douren Tang can reduce the serum level of IL-6，TNF-α and improve the level of IL-10，which may be one of the mechanisms in the treatment of UC.

【Key words】UC（ulcerative colitis）；Zhusha Douren Tang；TNF-α；IL-10；IL-6

中图分类号:R285.5

文献标志码:A

文章编号:1004-745X（2016）01-0058-03

doi:10.3969/j.issn.1004-745X.2016.01.020

*基金项目：河南省南阳市科技攻关计划项目（2014GG048）

通信作者△（电子邮箱：nyyzbjm@126.com）

收稿日期（2015-10-11）