张金卫　卢　月　钟晓琴　何钰华　韩　凌

(广州中医药大学第二附属医院/广东省中医药科学院，广州510006)



羧甲基茯苓多糖对肿瘤坏死因子-α调控体外Caco-2细胞系生物学特性的影响①

张金卫卢月钟晓琴何钰华②韩凌

(广州中医药大学第二附属医院/广东省中医药科学院，广州510006)

[摘要]目的：体外实验研究羧甲基茯苓多糖(Carboxytmethylpachymaran, CMP)对肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)调控体外Caco-2细胞系生物学特性的影响，并初步探讨其机理。方法：TNF-α诱导Caco-2细胞建立损伤模型，100 μg/ml CMP干预上述模型，分别从细胞单层跨膜电阻(TER)、酚红透过率、紧密连接蛋白Claudin-1表达量以及分布方面评价造模情况和CMP干预情况。结果：TNF-α诱导Caco-2细胞TER明显下降(P<0.01)，酚红透过率明显升高(P<0.01)，Claudin-1蛋白表达降低、Claudin-1蛋白分布毛糙、锯齿样改变、荧光强度变弱，提示造模成功； CMP干预后，TER明显升高(P<0.01)，酚红透过率明显降低(P<0.01)，Claudin-1蛋白的表达量升高，Caudin蛋白的分布变得光滑、荧光强度增强。结论：CMP能够有效的逆转TNF-α调控的体外Caco-2细胞系生物学特性，可能与恢复Claudin-1蛋白表达和分布有关， CMP可能是治疗炎症性肠病的潜在有效药物。

[关键词]羧甲基茯苓多糖；肠道黏膜屏障；炎症性肠病；紧密连接

炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是由肠道黏膜免疫调节紊乱、肠道黏膜屏障异常、肠道持续感染、环境与遗传等因素共同参与的病因、病机未完全阐明的非特异性反复发作性慢性肠道炎症，包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn′s disease,CD)[1-5]。目前，仍没有彻底治愈IBD的有效方法，寻找治疗IBD的特效药物一直是医学界的研究热点。茯苓，是多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，具有健脾除湿的功效，是“四君八珍”之一，临床常用治疗胃肠疾病，但其作用机理仍缺乏深入研究。茯苓的主要成分为茯苓多糖，包括β-茯苓聚糖、葡萄糖、蔗糖和果糖等。β-茯苓聚糖占茯苓菌核干重的93%，其在碱性条件下与氯乙酸反应生成水溶性的羧甲基茯苓多糖(Carboxytmethy-lpachymaran, CMP)(图 1)。大量临床与实验研究表明，茯苓和茯苓多糖对胃肠疾病具有良好的治疗、预防作用，但是，对水溶性良好的 CMP研究较少，基于此，本研究以肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-alpha TNF-α)诱导Caco-2细胞建立损伤模型，观察CMP对TNF-α调控的体外Caco-2细胞系生物学特性的影响，并探讨其分子机制以及用于治疗炎症性肠病的潜在能力。

图1　羧甲基茯苓多糖结构(CMP)Fig.1　Structure of CMP

1材料与方法

1.1细胞株和主要试剂人结肠腺癌细胞株Caco-2购自武汉大学细胞库；DMEM培养基，胎牛血清，非必须氨基酸，双抗等细胞培养试剂购自GIBCO公司；TNF-α购自Pepro Tech公司；CMP购自恒绿源科技有限公司；酚红购自源叶公司；MILLIcell ERS-2购自millipore公司；Claudin-1抗体、FITC标记的羊抗兔IgG等购自Sigma公司。

1.2实验方案

1.2.1细胞培养人结肠腺癌细胞株Caco-2用含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%双抗的高糖DMEM培养基，放置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养，每1～2 d更换新鲜培养基。当细胞融合70%～80%时，用0.25%EDTA将其消化，用于传代或种板。

1.2.2细胞分组将细胞随机分为3组，即正常组(C)、模型组(M)和给药组(D)。当细胞适合造模和给药时，C组用常规的培养基培养，M组和D组用含有100 ng/ml TNF-α的完全培养基培养，24 h后C组和M组更换常规培养基，D组更换为含有100 μg/ml CMP的完全培养基，培养24 h。

1.2.3单层跨膜电阻实验(TER)Caco-2细胞接种在Transwell板中，隔天更换新鲜培养基，细胞生长到10天电阻值稳定时，按照细胞分组的方法分组和给药，并用细胞电阻仪检测电阻值。

1.2.4酚红透过率实验检测Transwell板中细胞电阻后，移除培养液，用PBS(1×)清洗两次，向外孔加入600 μl纯水，内孔加入100 μl 20 mg/L的酚红，放置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养4 h。取外孔溶液150 μl与50 μl 600 μmol/L NaOH溶液混合，用酶标仪检测波长570 nm的OD值。

1.2.5免疫印迹实验Caco-2细胞接种在6孔板中，隔天更换新鲜培养液，当细胞长成单层屏障时，按照细胞分组的方法分组和给药，并移除培养基，用PBS(1×)清洗3次，RIPA裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min，4℃离心10 min取上清，BCA法检测蛋白浓度，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，Claudin-1抗体(1∶2 500)孵育4℃过夜，TBST(1×)洗涤，10 min/次，3次，羊抗兔IgG二抗孵育1 h，TBST(1×)洗涤，10 min/次，3次，化学显影，检测蛋白表达。以GAPDH为内参照计算相对灰度值，进行统计学分析。

1.2.6免疫荧光实验Caco-2细胞接种在24孔板中，隔天更换新鲜培养液，当细胞长成单层屏障时，按照细胞分组的方法分组和给药，并移除培养基，用PBS(1×)清洗3次，4%多聚甲醛溶液固定30 min，移除多聚甲醛，PBS(1×)清洗3次，加入Claudin-1抗体，室温孵育60 min，移除Claudin-1抗体，PBS(1×)清洗，10 min×3次，加入FITC标记的羊抗兔IgG，室温避光孵育60 min,PBS(1×)清洗，10 min×3次，荧光显微镜下观察、拍照。

2结果

2.1CMP升高TNF-α损伤的Caco-2细胞跨膜电阻值(TER)100 ng/ml TNF-α诱导Caco-2细胞24 h，TER值明显下降，与正常组比较有统计学意义(P<0.01)图2，表明TNF-α损伤了Caco-2细胞，成功建立了损伤模型；加入100 μg/ml CMP后，逆转了TNF-α的损伤作用，给药组与模型组比较具有统计学意义(P<0.01,图2)，表明CMP有效逆转了TNF-α对Caco-2细胞的损伤作用。

2.2CMP逆转TNF-α损伤的Caco-2细胞酚红透过率(transmittance)TNF-α诱导Caco-2细胞的酚红透过性明显升高，与正常组比较差异有统计学意义(P<0.01，图3)，表明TNF-α使细胞与细胞之间的间隙增大； CMP修复了TNF-α损伤的细胞间隙，给药组与模型组比较具有统计学意义(P<0.01，图3)。这与单层细胞跨膜电阻实验结果一致，都表明TNF-α损伤了Caco-2细胞， CMP对其损伤具有明显的修复作用。

图2　CMP升高TNF-α损伤的Caco-2细胞跨膜电阻值Fig.2　CMP increaces TER of Caco-2 cell induced by TNF-αNote: C.Normal group;M.Induced with 100 ng/ml TNF-α;D.Treat with 100 μg/ml CMP for 24 hours.*.P<0.01,M vs.C;#.P<0.01,D vs.M

图3　CMP逆转TNF-α损伤的Caco-2细胞酚红透过率Fig.3　Repair effect of CMP to phenol red transmittance of Caco-2 cell induced by TNF-αNote: C.Normal group;M.Induced with 100 ng/ml TNF-α;D.Treat with 100 μg/ml CMP for 24 hours.*.P<0.01,M vs.C;#.P<0.01,D vs.M.

2.3CMP修复TNF-α损伤的Caco-2细胞Claudin-1蛋白表达100 ng/ml TNF-α诱导Caco-2细胞24 h，Claudin-1蛋白表达明显下降，与正常组比较有统计学意义(P<0.01，图4A)，表明TNF-α破坏了紧密连接，成功建立了Caco-2细胞紧密连接损伤模型；加入100 μg/ml CMP后，逆转了TNF-α的损伤作用，给药组与模型组比较具有统计学意义(P<0.05，图4B)，表明 CMP有效修复了TNF-α对Caco-2细胞紧密连接蛋白Claudin-1的损伤。

2.4CMP修复TNF-α损伤的Caco-2细胞Claudin-1蛋白表达正常对照组 Claudin-1 蛋白沿着细胞膜呈蜂巢样线性分布，荧光强度很强(图5C)。

图4　Claudin-1蛋白表达Fig.4　Expression of Claudin-1 proteinNote: A.Claudin-1 protein expression in different groups;B.Relative expression ratio of claudin-1 protein with GAPDH.C.Normal group;M.Induced with 100 ng/ml TNF-α;D.Treat with 100 μg/ml CMP for 24 hours.*.P<0.01,M vs.C;#.P<0.05,D vs.M.

图5　CMP修复TNF-α损伤的Caco-2细胞claudin-1蛋白分布Fig.5　Repair effect of CMP to clauidn-1 protein′s distribution of Caco-2 cell induced by TNF-αNote: C.Normal group;M.Induced with 100 ng/ml TNF-α;D.Treat with 100 μg/ml CMP for 24 hours.

TNF-α诱导的肠道黏膜屏障损伤组，Claudin-1蛋白的分布变得毛糙、锯齿样改变、荧光强度变弱(图5,M)，提示TNF-α损伤了Caco-2细胞Claudin-1蛋白的分布。给予 CMP干预后，逆转了TNF-α的损伤，Claudin-1蛋白分布变得光滑，荧光信号强度较强(图5D)，表明 CMP修复了Claudin-1蛋白的表达。

3讨论

IBD在国外是常见的疾病，患病率约为40/10万～100/10万。在我国，该病的患病率有逐年增加的趋势[6]，但其确切的发病机制尚未明确。由肠道黏膜免疫系统紊乱所致的炎症反应在IBD的发生、发展以及转归中发挥着重要的作用[7]。肠黏膜屏障主要由肠黏膜表层的黏液层、上皮细胞层、黏膜基底膜构成，主要包括机械屏障、化学屏障、生物屏障和免疫屏障，其阻止肠腔内细菌、食物抗原等物质与肠黏膜固有层免疫细胞接触，预防固有层免疫细胞激活[8,9]。肠黏膜细胞间的连接复合体包括紧密连接(Tightjunction,TJ)、黏附连接(Adhesion junction,AJ)、缝隙连接(Gapjunction,GJ)及桥粒(Desmosome)等，其中TJ位于靠近顶侧的细胞侧面，由多种动态变化的蛋白组成，对维持肠黏膜屏障功能起着重要作用。TJ一旦受到损伤，肠腔内的细菌等有毒大分子物质穿过黏膜屏障进入体循环，引起包括炎症性肠病在内的许多疾病。研究表明TNF-α等细胞因子调控着紧密连接的动态变化[10]。本实验以TNF-α诱导Caco-2细胞，其跨膜电阻值降低、酚红透过率升高，表明使Caco-2细胞间的空隙增大，成功建立了损伤模型。在TNF-α诱导下，Claudin-1蛋白表达降低，Claudin-1蛋白分布毛糙、锯齿样改变、荧光信号强度变弱，同时证明了造模成功，并且表明这种对Caco-2细胞损伤与TJ上的Claudin-1蛋白表达和分布有关。

四君子汤出自宋代《太平惠民和剂局方》，由党参、白术、茯苓、甘草组成，是益气健脾，补益正气的经典方剂，对消化系统、免疫系统具有很好的调节作用。随着对四君子汤研究的深入，发现茯苓具有较好治疗胃肠疾病、调节免疫系统的作用。 CMP是茯苓的有效成分β-茯苓聚糖在碱性条件下与氯乙酸反应的产物，其与茯苓、茯苓多糖、β-茯苓聚糖相比水溶性良好，因此更有利于临床应用。张晓丹等[11]研究发现，茯苓能够部分恢复脾气虚大鼠模型胃肠胀气、胃肠壁变薄、大肠充血水肿，并能升高小肠推进率，对脾气虚腹泻大鼠胃肠形态及水液代谢皆有改善作用。韩凌等[12,13]发现，茯苓多糖对大鼠小肠上皮细胞株IEC-6细胞具有促增殖抗迁移的作用。虽然茯苓和茯苓多糖已经证明能够有效治疗、预防胃肠疾病，但是 CMP治疗胃肠疾病的研究仍是空白。本实验以 CMP干预TNF-α诱导的Caco-2细胞损伤模型为中心展开研究。 CMP上调损伤模型中单层跨膜电阻值和降低酚红的透过率，表明 CMP有可能减小Caco-2细胞与细胞间的空隙，有效的阻止肠腔内细菌、内毒素等有害物质穿过屏障与肠黏膜固有层免疫细胞接触，引发固有层免疫细胞激活，从而可以有效避免IBD的发生、发展。为了进一步研究 CMP干预的作用机理，我们进一步做了TJ结构上Claudin-1蛋白的免疫印迹和免疫荧光实验，结果表明 CMP修复了TNF-α损伤的TJ结构上Claudin-1的表达和分布，使其表达增加，分布变得光滑、荧光强度增强。因此，我们认为 CMP能够有效逆转TNF-α调控的体外Caco-2细胞系生物学特性，可能与Caco-2细胞TJ结构上Claudin-1蛋白表达和分布有关，是治疗IBD的潜在药物。

肠上皮细胞间的TJ由50多种蛋白构成，分为结构蛋白(Claudin、Occludin、JAM等)和功能蛋白(E钙黏素、肌动蛋白、肌球蛋白、Cingulin、胞内连接蛋白Z0-1等)，结构蛋白构成细胞的结构骨架，功能蛋白连接细胞骨架和膜蛋白，并传递信号[14,15]。本实验初步证明， CMP具有有效修复受损的肠道黏膜屏障的作用，这一作用与恢复TJ结构上Claudin-1蛋白有关。我们将继续研究 CMP对TJ的其它蛋白的影响以及信号通路的机制。

参考文献：

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[13]韩凌,王培训,危建安,等.四君子汤总多糖及单味药多糖对大鼠小肠上皮细胞株IEC-6细胞迁移作用的比较研究[J].山东中医杂志,2006,8(25):544-546.

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[15]张金卫,林汉杰,韩凌.肠上皮细胞紧密连接研究进展[J].中国医药导报,2015,12(6):160-163.

[收稿2015-10-24修回2015-11-06]

(编辑许四平)

Effect of Carboxytmethylpachymaran on tumor necrosis factor alpha′s control in vitro Caco-2 cell biological characteristics

ZHANGJin-Wei,LUYue,ZHONGXiao-Qin,HEYu-Hua,HANLing.

TheSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofTCM/GuangdongProvinceAcademyofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510120,China

[Abstract]Objective:To research the effect of Carboxytmethylpachymaran on tumor necrosis factor alpha′s control in vitro Caco - 2 cell biological characteristics and to preli minary discussion on its mechanism.Methods: Tumor necrosis factor-alpha(TNF-α) induce Caco-2 cells to establish damaged model,and then 100 μg/ml CMP intervenes the above model.So we evaluatod model and CMP intervention from TER,phenol red transmittance,tight junction protein claudin-1 expression and distribution.Results: TNF-α induced Caco-2 cells TER decreased obviously(P<0.01),phenol red transmittance increased obviously(P<0.01),expression of claudin-1 protein decreases and protein of claudin-1 changed in distribution was breaked,fluorescence intensity weaken,suggesting building success.TER increased obviously(P<0.01),phenol red transmittance decreases obviously(P<0.01),expression of claudin-1 protein decreases(P<0.05),protein of claudin-1 becomes smooth and stronger fluorescence intensity with CMP intervenes.Conclusion: CMP can effectively repair Caco-2 cells′ damage,which may be associated with recovery claudin-1 protein expression and distribution,and CMP could be potentially effective drugs for the treatment of inflammatory bowel disease.

[Key words]CMP;Intestinal mucosal barrier;IBD;TJ

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.014

作者简介：张金卫(1988年-)，男，在读硕士，主要从事免疫相关研究。通讯作者及指导教师：韩凌(1974年-)，女，博士，副研究员，博士生导师，主要从事补益药的免疫药理相关研究，E-mail:linghan36@163.com。

中图分类号R285.5

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)05-0665-04

①本文受国家自然科学基金(81202635)资助。

②广州中医药大学中药学院，广州510006。