李小林　王博远　程伟宁　吴　纯　李大主　朱　静　汪俊军

(武汉市新洲区人民医院心内科，武汉430400)



HSP60口服耐受诱导调节T细胞Foxp3去甲基化抑制动脉粥样硬化①

李小林王博远②程伟宁吴纯②李大主②朱静汪俊军

(武汉市新洲区人民医院心内科，武汉430400)

[摘要]目的：探讨Foxp3去甲基化在HSP60口服耐受抑制动脉粥样硬化中的作用。方法：8周龄载脂蛋白E-/-小鼠分别口服重组鼠热休克蛋白60-PBS溶液和单纯 PBS溶液,连续5天后高脂饲养 12周，监测期间两组脾细胞CD4+CD25+调节性T细胞内DNA甲基化转移酶表达，Foxp3启动子甲基化水平，细胞因子分泌程度，脾细胞中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞百分比，斑块面积。结果：与对照组比较,口服热休克蛋白 60组脾细胞CD4+CD25+调节性T细胞内DNA甲基化转移酶表达显著降低，Foxp3启动子甲基化水平显著降低，抑炎因子 IL-10和 TGF-β分泌显著增加,而促炎因子IFN-γ分泌显著降低，脾细胞中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞比例明显提高，斑块面积显著减小。结论：HSP60口服耐受通过诱导调节T细胞Foxp3基因去甲基化导致调节T细胞功能增强，分化增加，抑制动脉粥样硬化。

[关键词]热休克蛋白60；动脉粥样硬化；Foxp3；调节T细胞

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是一种与免疫炎症反应密切相关的慢性炎症性疾病，特异性免疫在AS炎症反应中起重要作用[1,2]，诱导机体对特异性抗原免疫耐受抑制AS是近年研究的热点。前期研究表明，口服重组鼠热休克蛋白60抗原(HSP60)可诱导体内调节性T细胞(Treg)的分化，抑制系统炎症反应，进而抑制AS[3-6],但是HSP60口服调控Treg以抑制AS的分子机制尚不清楚。叉头蛋白Foxp3是迄今所发现的Treg的最关键的和特异性的转录因子，决定着Treg的发育和免疫调节功能。Foxp3甲基化谱表明，去甲基化是Foxp3的稳定表达和具备抑制功能的前提[5-9]。本文探讨Foxp3去甲基化在HSP60口服诱导Treg分化抑制AS中的作用。

1材料与方法

1.1动物与试剂8周龄C57BL/6J 载脂蛋白E(apoE)-/-雄性小鼠购自北京维通利华有限公司；重组小鼠HSP60购自Stressgen公司；提DNA试剂盒及PCR试剂盒为TaKaRa Biotec公司产品；DNA甲基化相关检测盒和DNA甲基化转移酶1(DNMT1)抗体购自Sigma公司；氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)购自Yiyuan Biotechnologies公司；TGF-β、IL-10和IFN-γ ELISA试剂盒购自Phar mingen公司；PE标记抗Foxp3抗体、APC标记抗CD25抗体、FITC标记抗CD4抗体均为美国BD公司产品。

1.2方法

1.2.1小鼠分组和高脂饲养实验小鼠分2组：HSP60口服耐受组(n=30)：5 μg HSP60溶于500 μl PBS液中灌胃；PBS口服对照组(n=30)：只用500 μl PBS灌胃。连续处理五天，间隔2天后用含有1%胆固醇，30%脂肪的饲料喂养，于0、2、4、8和12周等时间点处死动物，行后续实验。

1.2.2斑块病理分析10%乌拉坦麻醉，取出心脏和主动脉段，置于 4%甲醛中保存，常规石蜡包埋，垂直主动脉瓣开口血管切片行HE 染色，计算主动脉瓣切面斑块面积。

1.2.3脾细胞中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞百分比检测取各组小鼠脾细胞，分离淋巴细胞，调细胞浓度到1×109L-1， 加入FITC-anti CD4， APC-anti CD25，室温避光孵育 30 min， PBS冲洗，离心弃上清液，加固定液，避光反应30 min，将破膜剂加入待测细胞中，室温避光反应 10 min，离心弃上清。重悬细胞，加入PE标记的Foxp3抗体，吹匀，4℃避光反应 30 min，离心弃上清，加入250 μl流式细胞液重悬细胞，用流式细胞仪检测CD4+CD25+Foxp3+T细胞占总CD4+T细胞的百分比。

1.2.4混合淋巴细胞反应上清液细胞因子检测用流式细胞术从同系ApoE-/-鼠分选CD4+CD25-T 细胞作为效应性T细胞(Te)，调整细胞密度为5×104/孔，分别加入从HSP60口服耐受组和PBS口服对照组分选的CD4+CD25+T 细胞(Treg细胞与Te细胞比例设为1∶2)，去除红细胞的同系ApoE-/-鼠脾细胞作为抗原提呈细胞(APC)，调整密度为 2×104/孔，均加入ox-LDL(终浓度50 μg/ml)，于96 孔培养板中 37℃、 5%CO2孵育。5 d后收集上清液并检测 IFN-γ、TGF-β 和 IL-10 的浓度(ELISA法)。

1.2.5Foxp3甲基化分析流式细胞术分选各组CD4+CD25+Treg，提取DNA。按DNA甲基化试剂盒说明书操作，行重硫酸盐处理使DNA所有未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，PCR扩增Foxp3启动子区域目的基因，上游引物序列：5′-TATAAAAACCCCCCCCCACC-3′，下游引物序列：5′-TGGTGAAGTGGATTGATAGAAAAGG-3′，扩增产物为 198 bp，扩增后尿嘧啶转变成胸腺嘧啶，行基因测序，对PCR产物进行测序并且与原始序列比较，分析Foxp3启动子区甲基化水平。

1.2.6DNA甲基化转移酶(DNMT)测定流式细胞术分选各组CD4+CD25+Treg，提取蛋白。制备 SDS-PAGE 凝胶后上样电泳，电泳结束后，使用转移电泳装置，在 4℃， 400 mA 恒流条件下电转 120 min，将蛋白转移到 PVDF 膜上。5%脱脂牛奶室温封闭，室温2 h，TBST洗膜，孵育一抗兔抗鼠DNMT抗体(1∶500稀释)，兔抗鼠β-actin抗体(1∶1 000稀释)2 h或4℃过夜。TBST 洗膜3次，每次 10 min。用加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶8 000稀释)，室温孵育2 h。TBST 洗膜3次，每次10 min。用Image Lab成像系统检测并收集图像。

2结果

2.1各组ApoE-/-小鼠主动脉瓣处粥样斑块面积高脂饲养4、8和12 周后,病理学检查显示,HSP60口服组主动脉粥样斑块面积明显小于PBS对照组斑块面积(P<0.05)，高脂饲养0周和2周，两组主动脉粥样斑块面积无明显差异(P>0.05)。见图1。

2.2脾细胞中 CD4+CD25+Foxp3+细胞表达高脂饲养2、4、8和12周后,HSP60口服组CD4+脾细胞中CD25+Foxp3+细胞阳性率明显高于PBS对照组(P<0.05)。高脂饲养0周，两组CD4+脾细胞中CD25+Foxp3+细胞阳性率无明显差异(P>0.05)。见图2。

2.3混合淋巴反应体系上清液细胞因子高脂饲养0、2、4、8和12 周后,HSP60口服组混合淋巴反应体系上清液TGF-β和IL-10浓度明显高于PBS对照组(P<0.05)，IFN-γ浓度明显低于PBS对照组(P<0.05)。见图3。

2.4Foxp3甲基化水平高脂饲养0、2、4、8和12 周后,HSP60口服组脾脏CD4+CD25+T细胞Foxp3启动子区甲基化水平明显低于PBS对照组(P<0.05)。见图4。

图1　各组主动脉粥样斑块面积比较Fig.1　Atherosclerotic lesion in different groupsNote: A.Representative cross section of lesion formation in the aortic valve area stained with Oil-Red-O at 12 weeks after HDF；B.Lesion size in different groups are showed,*.P<0.05,vs Control at the same week.

图2　各组脾细胞中CD4+CD25+Foxp3+细胞占总CD4+脾细胞百分比的比较Fig.2　Percentage of CD25+Foxp3+ amongst CD4+ T cells from spleen detected by flow cytometryNote: A.Median representative flow cytometry of CD4+CD25+Foxp3+ cells from spleen at 12 weeks after HFD；B.Dates of CD25+Foxp3+/CD4+ cells in differen groups are shown,*.P<0.05,vs Control at the same week.

图3　混合淋巴反应体系上清液细胞因子浓度Fig.3　Level of cytokines in medium of mixed lymphocytesNote: *.P<0.05,vs Control at the same week.

图4　各组脾CD4+ CD25+ T细胞Foxp3甲基化水平Fig.4　Foxp3 methylation level of CD4+CD25+ splenic T cellNote: *.P<0.05,vs control at the same week.

图5　各组脾CD4+ CD25+ T细胞DNMT1表达水平Fig.5　DNMT1 expression in CD4+CD25+ splenic T cellNote: A.Representative bands of DNMT1 expession in CD4+CD25+ splenic T cell at 0 week after HFD.B.Dates of DNMT1 expression are shown,*.P<0.05,vs control at same week.

2.5DNA甲基化转移酶1(DNMT1)高脂饲养0、2、4、8和12 周后,HSP60口服组脾脏CD4+CD25+T细胞内DNMT1表达明显低于PBS对照组(P<0.05)。见图5。

3讨论

AS 是动脉血管壁的一种慢性疾病，特异性免疫在AS炎症反应中起重要作用[1,2,6]。表达HSP60的病原体(肺炎衣原体等)致敏或感染ApoE-/-小鼠，可加速AS发展[10]。因此粘膜途径及口服方式诱导机体对AS相关抗原的免疫耐受是AS防治一种极有希望的手段，正成为相关领域的研究热点。与其他学者研究结果一致，前期研究发现，给高脂饲养ApoE-/-小鼠口服HSP60可显著性抑制小鼠AS斑块形成。进一步的研究发现，口服HSP60可诱导体内调节性T细胞(Treg)的分化，抑制系统炎症反应，进而抑制AS[3]。Treg是机体内的专职和功能强大的抑制性T细胞，在机体免疫耐受和免疫稳态维持中起重要作用，其在AS炎症反应中的调节作用也受到极大的关注。然而，时至今日，人们对抗原口服诱导Treg分化的机制知之不多。

叉头蛋白Foxp3是迄今所发现的Treg最关键的和特异性的转录因子， Foxp3决定着Treg的发育和免疫调节功能。Foxp3表达的缺陷可导致严重的自身免疫性疾病的产生，体内转染Foxp3或诱导其

表达可抑制AS、自身免疫性疾病及抗移植免疫等。近年来，表观遗传学研究表明，Foxp3的稳定性受环境因素对DNA的修饰作用的影响，其中包括DNA甲基化，修饰部位位于DNA上的调节性T细胞特异性去甲基化位点(Treg-specific demethylated region，TSDR)。在DNA甲基转移酶(DNMT)作用下，DNA被甲基化，直接影响对甲基化敏感的Foxp3的作用，使它们失去结合DNA 的功能从而阻断转录，使Treg得分化和功能受抑制。Treg独特的FOXP3启动子的甲基化谱表明，去甲基化是FOXP3的稳定表达和具备抑制功能的前提。研究表明，FOXP3甲基化与多种免疫炎症性疾病的发生发展有关，最近研究认为FOXP3甲基化与冠心病患者AS病变程度相关，而FOXP3的去甲基化又与自身免疫性疾病治疗的良性转归有关[5-9]。

本实验通过监测HSP60口服耐受ApoE-/-小鼠的Foxp3甲基化状态，Treg分化和功能，以及斑块水平，探究Foxp3去甲基化在HSP60口服耐受抑制AS中的作用。HSP60口服耐受后小鼠脾细胞CD4+CD25+调节性T细胞内DNMT表达降低，FoxP3启动子甲基化水平降低，抑炎因子 IL-10和 TGF-β分泌升高， 而促炎因子IFN-γ分泌减少，脾细胞中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞增加，高脂饲养12周后斑块面积明显低于对照组。表明HSP60口服耐受可以诱导小鼠Treg的Foxp3基因去甲基化，导致Treg功能增强，分化增加，抑制AS。希望此机制的研究结果可以为 AS 的预防提供新的干预靶点。

参考文献：

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[10]Wick G,Jakic B,Grundtman C.The role of heat shock proteins in atherosclerosis[J].Nat Rev Cardiol,2014,11(9):516-529.

[收稿2015-08-19]

(编辑许四平)

Oral tolerance to HSP60 induces regulatory T cell Foxp3 demethylation and inhibits atherosclerosis

LIXiao-Lin,WANGBo-Yuan,CHENGWei-Ning,WUChun,LIDa-Zhu,ZHUJing,WANGJun-Jun.

DepartmentofCardiology，XinzhouDistrictPeople′sHospitalofWuhan,Wuhan430400,China

[Abstract]Objective:To explore the role of regulatory T cell Foxp3 demethylation in the atherosclerosis inhibition induced by oral tolerance to HSP60.Methods: 8 weeks old ApoE-/-mice were randomly divided into two groups that were orally ad ministrated PBS plus HSP60 and only PBS separately for 5 days,and then a high-cholesterol diet was started 5 days after the last treatment for 12 weeks.During this time,the expression of DNA methyltransferase and the level of Foxp3 methylation in CD4+CD25+ regulatory T cells was measured,cytokines in the supernatant were measured,percentage of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells in the splenocytes was analyzed,pathological analysis of plaque was performed.Results: With those in the PBS control group,in the HSP60 group the express of DNA methyltransferase and the level of Foxp3 methylation in CD4+CD25+ regulatory T cells was obviously decreased,the level of IL-10 and TGF-βwere obviously increased,the level of IFN-γ was obviously decreased,percentage of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells in the splenocytes was obviously increased,size of atherosclerotic plaques was obviously decreased.Conclusion: Oral tolerance to HSP60 Induces regulatory T cell Foxp3 demethylation,which could increase the function and number of regulatory T cell,to inhibit the formation of atherosclerosis plaque.

[Key words]HSP60;Atherosclerosis;Foxp3;Regulatory T cell

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.006

作者简介：李小林(1975年-)，男，硕士，副主任医师，主要从事冠心病发病机理及其诊断与治疗的研究，E-mail: lxl1268@163.com。

中图分类号R392.11

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)05-0633-04

①本文为武汉市卫计委科研基金资助项目(No.WX14B37)。

②华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科，武汉430022。