张 坤，张 恒，于志明，陈锐博，郑振宇，李春丽

实时荧光定量PCR已成为分析基因表达水平的常用方法，该方法具有灵敏度高、操作简便，重复性好等优点［1］。在实际研究中，基因表达的分析结果易受很多因素的影响，通常需要内参基因进行校正，以得到均一化的结果。常用的内参基因一般为管家基因(Houseking genes)。理想的管家基因应该在不同组织、不同细胞、不同时间阶段及其不同实验条件下，都能稳定表达的基因。研究表明，目前没有一种管家基因可以在任何条件下都表达恒定，在不同的组织中或者不同条件下，其表达是有变化的［2－3］。以不同的管家基因作为内参会得到完全不同的结果，表达量会相差几倍，几十倍，甚至高达上百倍［4－6］。盲目地选择一个管家基因做内参，甚至可能得出错误的结论［7－9］。因此，利用RT-qPCR技术来研究基因表达时，需要根据试验对象及条件选择合适的内参基因进行校正分析，以得到相对真实可信的结果。对于在不同条件下内参基因的筛选已经有很多报道，但是多集中在植物和动物方面，对微生物，尤其是大肠杆菌内参基因的报道较少［10－12］。大肠杆菌是引起人类和动物感染和食物中毒最常见的病原菌之一，大肠杆菌引起的疾病如仔猪的黄白痢等长期困扰着养殖业的发展，并且其抗药性越来越严重，使得本来可以医治的疾病变得无药可医。猪的发病率、死亡率居高不下，极大地制约了养猪业的健康发展，同时，也严重地威胁着人类的健康［13－15］。防御素是生物体内自身分泌产生的具有强烈抗菌作用的多肽，并且具有分子量小、热稳定性强、水溶性好、无免疫原性、无任何药物残留等优点。猪自身分泌的防御素约10多种。其中，猪β防御素2(pBD2)对细菌具有较强的杀灭作用，与其它发现的猪防御素相比，其抗菌活性高，细胞毒性小，在猪病防治中具有重要意义［16－18］。作者在分析大肠杆菌与pBD2共培养后差异表达的基因时，为了保证试验数据的正确可靠，根据已有的报道［10－12］，在大肠杆菌中选用了6个管家基因作为候选的内参基因，利用荧光定量PCR技术研究大肠杆菌在不同浓度pBD2胁迫下，各个基因表达的稳定性，为后续进行大肠杆菌与pBD2共培养前后差异表达的基因分析奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌ATCC 25922购买于北京普通微生物菌株储存中心。

1.2 方法

1.2.1 猪β防御素2的诱导表达和纯化 在实验室前期构建的BL-pET-pBD2工程菌株的基础上，按照文献［18］进行诱导表达和蛋白纯化。纯化的蛋白采用BCA试剂盒(康为世纪生物有限公司)进行浓度的测定。

1.2.2 细菌培养 将大肠杆菌划线培养，挑取单菌落于20 mL液体培养基中，220 r·min－1，37 ℃震荡培养过夜，取出1 mL菌液加入到含有200 mL液体培养基的锥形瓶中，继续震荡培养2～3 h，测定调整其光吸收值OD600为1，使菌体的浓度达到109cfu·mL－1。

1.2.3 细菌与蛋白共培养 将1 mL质量浓度为0，37.5，75，150 mg·L－1纯化后的 pBD2 溶液分别与1 mL109cfu· mL－1的大肠杆菌在37℃震荡培养1 h或者4 h。然后12 000 g离心5 min，取菌体沉淀进行RNA提取。

1.2.4 总 RNA提取 按照文献［19］进行细菌RNA的提取并略作修改。将菌体沉淀悬浮于1 mL 15 mmol·L－1Tris-HCl 溶液中(pH 8.0，含 0.45 mol·L－1蔗糖，8 mmol·L－1EDTA，2 mg·mL－1溶菌酶)，2℃下作用40 min。5 900 g离心5 min，收集菌体，而后悬浮于 100 μL 80 mmol·L－1Tris.HCl缓冲液中(pH 7.5，含 10 mmol·L－1MgCl2，和10 mmol·L－1β － 巯基乙醇)，再补充225 μL 混合液(0.5%SDS，0.23 mg·mL－1蛋白酶 K，10 mmol·L－1EDTA，0.2 mg·mL－1肝素)，在 37 ℃ 孵育 20 min。再加入饱和氯化钠溶液160 μL，混匀后冰浴l0 min。10000 g离心l0 min，然后小心将上清液转移入新的1.5 mL离心管中，每管加l mL无水乙醇，－20℃过夜沉淀RNA。之后用l mL预冷的70%乙醇洗涤沉淀。等沉淀基本干燥后，用适量DEPC处理水溶解。

1.2.5 RNA的纯化 提取的总 RNA 20～50 μg用2 μL DNAaseⅠ(5 U·μL－1，Taka公司)，于37℃孵育 20 ～30 min 后(终体积50 μL)，加入50 μL DEPC水和100 μL混合液(V(氯仿)∶V(异戊醇)=24∶1)，12 000 g 离心5 min，取上清液，再加入10 μL 3 mol·L－1的乙酸钠溶液 (pH 5.2) 和 250 μL无水乙醇，冰上放置10 min。12 000 g离心5 min，而后70%的乙醇(DEPC水配置)洗脱沉淀，晾干后，加入适量DEPC水溶解RNA，放于－70℃冰箱保存待用。利用微量紫外分光光度计测量RNA的浓度和比值(Nanodrop ND 2000，Thermo Scientific公司)，取2 μL进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.6 内参基因的选择和引物设计 根据相关报道［10－12］，本试验选用大肠杆菌的 6 个管家基因(recA，aspC，ldh，gapdh，mdh，16S rRNA)作为候选的内参基因，设计的引物序列分别见表1，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.7 cDNA合成和实时荧光定量 PCR 参考PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit反应体系和反应条件合成cDNA，RT-qPCR反应体系参照荧光定量PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司)进行，以 2 μL的RNA进行逆转录，逆转录的产物进行荧光定量分析。反应体系为:SYBR Premix Ex Taq(2 × )10 μL，模板 cDNA 0.2 μL，上、下游引物各 0.8 μL，加三蒸水 8.2 μL，终体积20 μL。反应条件:95℃预变性5 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 15 s，40个循环。每个样本做3个平行，经Roche LightCycler?96的软件分析得到各样本的循环阀值(Ct值)。引物扩增效率分析时，对cDNA进行梯度稀释(10倍，100倍，1000倍等)，选择5个质量浓度梯度进行荧光定量分析，将它们的Ct值制成线性方程，得出斜率，根据E=10(－1/slope)－1计算其扩增效率，扩增效率在90%～110%符合引物扩增的要求。

表1 大肠杆菌候选内参基因的引物序列Table 1 Primer sequences of candidate reference genes of E.coli

1.2.8 用GeNorm软件进行数据分析 首先找到RT-qPCR中每个基因各样本中最低的循环阈值Ct值(表达量最高)，所有该基因的其他样本Ct值减去最低Ct值计算得到△Ct，此基因中最高表达水平的样本表达量定为1，其他每个样本相对于最高表达水平样本的相对表达量为2－△Ct，通过GeNorm软件分析基因的稳定性，以M值表示。M值越小，表达越稳定。

2 结果与分析

2.1 pBD2的诱导表达和纯化

按照文献［18］进行pBD2的诱导表达和蛋白纯化，纯化的蛋白如图1所示。图1显示，pBD2蛋白纯度较高。经BCA浓度检测，其质量浓度为352 mg·L－1，用PB缓冲液调整终质量浓度分别为0、37.5、75、150 mg·L－1。

2.2 RNA浓度测定及质量鉴定

将1 mL不同质量浓度的pBD2溶液与1mL 109cfu·mL－1的大肠杆菌于37℃共培养，在1 h和4 h取样进行RNA提取。纯化后的RNA经紫外分光光度计检测，所测样品的 OD260/OD280都在2.1左右，表明RNA的纯度较好，1%琼脂糖电泳分析提取的大肠杆菌的RNA，结果如图2所示，结果显示提取的RNA完整性较好，可以满足后续的实验。

图1 SDS-PAGE电泳纯化的pBD2蛋白Fig.1 SDS-PAGE analysis of the purified pBD2

图2 总RNA的琼脂糖凝胶电泳Fig.2 Electrophoresis of total RNA

2.3 内参基因引物的扩增效率及其特异性分析

通过对cDNA的稀释进行每个引物的扩增效率分析，得到的结果如表2所示。从表2可以看出，扩增效率为92% ～107%，符合荧光定量RCR对扩增效率的要求。并且大肠杆菌在不同样本中实时荧光定量的结果如图3所示，所有基因的溶解都是单一峰，没有非特异性条带和引物二聚体，其特异性良好。

表2 大肠杆菌候选内参基因的扩增效率参数Table 2 Parameters of candidate reference genes of E.coli by real-time PCR

图3 候选内参基因的熔解曲线Fig.3 Melting curve of candidate reference genes

2.4 候选内参基因在不同处理中的Ct值

所有内参基因在不同样品中的表达量如图4所示。从图4可以看到，大肠杆菌的6个内参基因，除了16S rRNA的Ct值比较低之外，其他基因的Ct值基本介于15～30之间，说明基因的荧光定量的结果相对准确。

图4 候选内参基因的Ct值Fig.4 Ct value of candidate reference genes

2.5 GeNorm程序分析大肠杆菌内参基因的稳定性

为筛选合适的内参基因，通过GeNorm软件分析内参基因的M值，结果如图5所示，M值都小于程序所推荐的临界值1.5，稳定性较好，稳定性的相对顺序为recA(0.706)﹥aspC(0.732)﹥gapdh(0.768) ＞ 16S rRNA(0.815)﹥ ldh(1.152)﹥mdh(1.266)，最稳定的是 recA，其次是 aspC和gapdh。

图5 GeNorm软件分析各候选内参基因的表达稳定值M值Fig.5 Expression stability M value of candidate reference genes by GeNorm software

2.6 候选内参基因的相对表达量

计算各个候选的内参基因在不同处理时的Ct平均值，以最大的Ct为1，采用△△Ct法对基因进行相对定量。候选内参基因的相对表达量的对数值如图6所示，从图6可以看到，16S rRNA的相对表达量最高，其次是mdh，而ldh的表达量最低。

图6 候选内参基因相对表达量的对数值Fig.6 The logarithmic relative expression of candidate reference genes

3 讨论

实时荧光定量PCR的特异性强，重复性好，已成为分析基因表达的一种常规技术，广泛应用于生物领域。内参基因的选择往往是试验成败的关键所在。如何正确地选择内参基因，与所研究的试验对象和条件密切相关，不同的试验情况往往需要不同的内参基因。本研究选择了6个大肠杆菌的管家基因作为候选内参基因，为了保证所设计的引物正确可靠，在设计完引物后又通过NCBI进行搜索，以确保引物的特异性，通过对引物扩增效率的分析也可知，所设计的引物满足了试验的要求。

RNA的质量对于荧光定量的分析至关重要，并且保证所提取细菌RNA具有poly(A)尾巴也是进行荧光定量的前提，细菌都有比真核生物mRNA短得多的poly(A)，并且容易降解，并且采用传统的酚提取，会使poly(A)尾巴减少［19］，所以本试验所取的大肠杆菌都处于对数生长期，并且不采用传统的饱和酚提取，都是为了保证所提取的RNA具有poly(A)的尾巴，以保证后续实验的进行。结果显示所提取的RNA质量比较好，并且完整性好。DNA的污染也是影响荧光定量的结果的一个因素，本试验采用DNAaseⅠ消化提取的RNA，以消除DNA的影响。

随着 GeNorm，NormFinder，Bestkeeper等工具的出现，对于候选内参基因的选择变得更加简单化和准确了［8，20］，GeNorm 软件是最常用的分析软件［10］，GeNorm是通过将某一个基因与其他基因的表达水平进行比较，对其表达的稳定性进行排序，通过GeNorm软件分析可知，大肠杆菌中候选的内参基因的M值都小于1.5，表明所选基因稳定性都比较好，其中recA的M值最低，表明其在pBD2的胁迫下表达最稳定的，其次是aspC和gapdh。recA和gapdh在原核中是常用的内参基因，我们的结果与其他条件胁迫下的结果比较一致［10，21］，16S rRNA 在不同条件下的表达是比较稳定的，但是其转录本比较高，不适合作为内参基因［10］，本研究的结果也显示16S rRNA的表达量最高，其Ct值最低，对于在分析表达量不是特别高的基因可能不适合。在猪β防御素2的选择压力下，大肠杆菌稳定的内参基因为recA，aspC和gapdh，本研究为大肠杆菌在猪β防御素2胁迫下差异表达的基因分析奠定了基础，同时为其他抗菌制剂胁迫下内参基因的筛选提供了参考。

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