杨惠娟，王 景，黄化刚，史宏志

生态条件对植物的影响是巨大的，同一品种在不同生态条件下会有不同的表型和生理反应。烟草是一种生态适应性较广泛的作物，在北纬60°与南纬40°间都有种植，且生长具有地域特点。烟叶的产量和质量受生态影响较大，相同的品种在不同的生态环境下的生长状况各异，因此，根据当地特点选育的烟草品种能够更好地适应当地气候条件，具有较好的烟叶品质［1－2］。贵州毕节属北亚热带季风湿润气候，夏无酷暑，冬无严寒，季风气候比较明显，降雨量较为充沛、河南宝丰属暖温带，为半湿润大陆性季风气候，四季分明，以春旱多风、夏热多雨、秋温气爽、冬寒少雪为特征［3－4］。2个地区都是主要的烟叶产区，都能够生产出优质的烟叶，但其内在品质有很大差别，风格截然不同。气候对植物生长的影响是通过影响植物的基因表达继而影响内在代谢水平，最终表现出对于不同气候的不同生长特性。蛋白质能体现生命有机体的生理代谢、信号转导等功能，蛋白质组是一个生命有机体所有蛋白质序列和蛋白质空间结构的总和，生命的特征是通过蛋白质及蛋白质之间的相互作用体现出来的。蛋白质组学是以基因组编码的所有蛋白质为研究对象，在生物个体不同的发育时期及不同的组织、器官等水平研究蛋白质的表达、结构、修饰等，在蛋白质的水平上探索蛋白质的表达及调控机制。其理论和方法已渗透到植物遗传学、植物生理学、植物发育生物学等诸多学科研究领域，在农业相关的生物科学领域得到了广泛的应用［5－6］。不同条件下的蛋白质组表达是有差异的，这造成了不同条件下各个生理活动的千差万别。那么，在蛋白质组水平探究植物对气候的响应是研究基因环境互作机制的现代化手段之一。毕纳1号是毕节烟区自育的品性优良烤烟品种，尤其适应毕节地区的气候特征。因此，为了研究烤烟对不同气候响应的分子机制以及贵州、河南两地的气候条件下烤烟的代谢差异的分子基础，本研究应用蛋白质组学研究手段对同一烤烟品种在两地气候条件下的蛋白质组表达差异进行了研究，筛选出响应气候变化的显著差异表达蛋白质，并进行相关分析，旨在为阐明植物对气候的响应途径及分子变化提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 品种及试验设置

烟草品种为毕纳1号，试验地设置在贵州毕节与河南宝丰。试验为盆栽试验，整个烟株生长期以营养液浇灌培养，每3～5 d给予1次新鲜营养液。营养液配方为:10 mmol·L－1KNO3;2 mmol·L－1(NH4)2SO4;1 mmol·L－1KH2PO4;1.5 mmol·L－1K2SO4;2 mmol·L－1CaCl2;2.5 ×10－1mmol·L－1MgSO4;2.5 × 10－2mmol·L－1KCl;1.25 ×10－2mmol·L－1H3BO3;1 ×10－3mmol·L－1MnSO4;1 × 10－3mmol·L－1ZnSO4;2.5 × 10－2mmol·L－1CuSO4;2.5 × 10－2mmol·L－1(NH4)6Mo7O24;1 ×10－1mmol·L－1Fe-EDTA。待烟叶进入旺长期，选取中部叶长为60 cm左右的叶片，混合取样，液氮冻存。

1.2 蛋白质样品的制备

将样品用液氮研磨至粉末，TCA/丙酮溶液(1∶9)沉淀过夜，离心 10 000 r·min－1，45 min，去除上清液，加入丙酮溶液，离心10 000 r·min－1，45 min，4℃去除上清液，重复2次。空气干燥。按10∶1加入蛋白裂解液，裂解液成分包括8 mol·L－1尿素，2 mol·L－1硫脲，4%CHAPS，2%IPG 缓冲液(pH 3 ～10)和 30 mmol·L－1二硫苏糖醇(DTT)。冰浴超声破碎(80 W，超声10 s，间歇15 s，共 10 次)，离心 10 000 r·min－1，30 min，4℃。上清液用0.22 μm滤管过滤，并使用 Bio-Rad protein assay reagent定量，－80℃低温保存。

1.3 双向电泳及图谱分析

双向电泳等电聚焦步骤按照IPGphor等电聚焦系统(Amersham Biosciences)说明书进行。将100 μg的蛋白质样品溶于500 μL的上样缓冲液上样于24 cm的电解质胶条中(pH 3～10，Non-Liner，Amersham Biosciences)，等电聚焦的程序设置为:30 V 12 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，8 000 V 8 h，500 V 4 h。结束后将IEF胶条放入平衡缓冲液(6 mol·L－1Urea，30%Glycerol，2%SDS，0.05 mol·L－1Tris pH 8.8，1%DTT)中孵育15 min，再将胶条转入另一平衡缓冲液中(6 mol·L－1Urea，30%Glycerol，2%SDS，0.05 mol·L－1Tris pH 8.8，2.5%碘乙酰胺)中，孵育15 min后。平衡结束将胶条转移至15%聚丙烯酰胺SDS分离胶上，进行蛋白质的分离，于15℃进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(Ettan DALT six electrophoresis unit，Amersham Biosciences)。电泳结束以银染法对凝胶进行快速银染色，采用高清晰度图像扫描仪(PowerLook 2100 xl－USB，UMAX)扫描凝胶，每个样品做3次重复。蛋白质表达图谱用 ImageMaster 2D Platinum 6.5(GE Healthcare)软件进行分析。蛋白质表达比值Ratio(打顶后/打顶前)大于1.50或小于－1.50的蛋白质点作为差异点。

1.4 胶内酶解及Ziptip脱盐

将胶粒切碎后转入EP管中，加入200～400 μL 100 mmol·L－1NH4HCO3/30%ACN 脱色液(银染:加入30 ～50 μL 30 mmol·L－1K3Fe(CN)6∶100 mmol·L－1Na2S2O3=1∶1 脱色液)，清洗脱色至透明，吸弃上清液，加入 100 mmol·L－1NH4HCO3，室温孵育15 min。吸弃上清液冻干，之后加入5 μL 2.5 ～10 mg·L－1测序级 Trypsin(Promega)溶液(酶与被分析蛋白质质量比一般为1∶20～1∶100)，37℃反应过夜，20 h左右;吸出酶解液，转移至新EP管中，原管加入 100 μL 60%ACN 和 0.1%TFA，超声15 min，合并酶解液冻干;若有较多盐分，则用Ziptip(millipore)进行脱盐。

1.5 质谱分析

冻干后的酶解样品，取2 μL 20%乙腈复溶。取1 μL溶解样品，直接点于样品靶上，让溶剂自然干燥后，再取0.5 μL过饱和 CHCA基质溶液(溶剂为50%ACN0.1%TFA)点至对应靶位上并自然干燥。样品靶经氮气吹净后放入仪器进靶槽并用串联飞行时间质谱仪(4800 Plus MALDI TOF/TOFTMAnalyzer)进行测试分析，激光源为355 nm波长的Nd:YAG激光器，加速电压为2 kV，采用正离子模式和自动获取数据的模式采集数据，一级质谱(MS)扫描范围为800～4 000 Da，选择信噪比大于50的母离子进行二级质谱(MS/MS)分析，每个样品点上选择8个母离子，二级质谱(MS/MS)累计叠加2 500次，碰撞能量2 kV，CID关闭。

1.6 数据库查询

使用4800 MALDI-TOF/TOF蛋白质组学分析器 分 析 (Applied Biosystems，Foster City， CA，USA)，运用 GPS ExplorerTM software Version 3.6(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA) 在MASCOT 搜索引擎(Version 2.2;Matrix Science，London，UK)中进行蛋白质和肽段鉴定。查询参数如下:NCBInr数据库，烟草属(2013，11，27)，胰蛋白酶消化，MS(一级质谱)和MS/MS(二级质谱)最大容许误差范围为100×10－6，肽片段相对分子质量最大容许误差范围为±0.4。选取质谱查询中蛋白质及离子置信区间均大于99%为鉴定信息。

2 结果与分析

2.1 宝丰与毕节气候条件下烤烟叶片蛋白质表达图谱

通过对两地烤烟叶片蛋白质双向电泳分离，取得蛋白质表达图谱如图1所示。经软件分析共得明显差异表达的蛋白质点12个，编号如图1中阿拉伯数字所示。编号为 561，551，795，791，1 320，1 334，1 377与1 184的8个蛋白质点在毕节气候下的样品中高表达(宝丰/毕节比值小于－1.50)，编号为880，570，1 421与1 551的4个蛋白质在河南气候下的叶片中高表达(宝丰/毕节比值大于1.50)。

图1 宝丰与毕节两地气候条件下生长的烟草叶片蛋白质组表达图谱Fig.1 Comparison of protein expression profiles between tobacco leaves grown under different climate conditions in Baofeng and Bijie

2.2 宝丰与毕节气候条件下烤烟叶片差异蛋白质的鉴定

对所得的差异表达蛋白质进行质谱和信息学分析，除去冗余蛋白质，根据蛋白质鉴定的标准，筛选出6个差异表达蛋白质，功能信息如表1所示。其中795与791，561与551经鉴定分别为同一蛋白质，且各项鉴定得分均较高，可能为同一蛋白质的不同电荷形式。3个在毕节样品中高表达的蛋白质为甘油醛三磷酸脱氢酶(561)、O－乙酰丝氨酸硫解酶(791)和光合系统Ⅱ23 kD放氧复合蛋白质(1 184)。3个在宝丰样品中高表达的样品为质体脂质相关蛋白质(880)、乙醇脱氢酶(570)和液泡ATP酶G亚基(1 551)。

表1 宝丰与毕节种植毕纳1号烟草鉴定所得的叶片差异表达蛋白质Table 1 Identification and annotation of the differentially expressed proteins in tobacco leaves of Bina1 grown in Baofeng and Bijie

3 结论与讨论

以毕纳1号为材料，选取气候差异明显的贵州毕节和河南宝丰进行试验，且整个生长季以营养液进行培养，消除了烤烟生长的土壤差异因素，可以准确地反映出同一烤烟品种在截然不同的两种气候条件下生长的叶片蛋白质表达的差异。

通过蛋白质表达谱表达分析，鉴定出差异蛋白质12个，经信息学分析，明确有生物信息学信息的蛋白质为6个。对蛋白质表达谱的分析表明，植物在不同的气候条件下有不同的生理反应，但仅个别的蛋白质会发生变化即对气候做出响应，而绝大多数的蛋白质并不会有明显的表达差异。这也说明植物对环境的适应过程是某些关键的因子在起作用，而不是整个生理过程发生巨大的变化。本试验鉴定所得的3个在毕节样品中高表达的蛋白质为甘油醛三磷酸脱氢酶、O－乙酰丝氨酸硫解酶和光合系统Ⅱ23 kD放氧复合蛋白质，尤其是甘油醛三磷酸脱氢酶与O－乙酰丝氨酸硫解酶在毕节叶片中表达量分别是宝丰样品中的2.64与2.63倍，远远高于差异蛋白质筛选的1.5倍的标准。另外，3个在宝丰样品中高表达的蛋白质为质体脂质相关蛋白质、乙醇脱氢酶和液泡ATP酶G亚基，表达量差异也都在2倍上下，表明这些蛋白质的表达具有显著的差异性。

从功能上分析，甘油醛三磷酸脱氢酶是糖酵解途径中的关键酶，ATP的生成即在该酶的控制下进行，控制着能量合成的多少;O－乙酰丝氨酸硫解酶催化半胱氨酸合成的最后一步，与半胱氨酸的含量密切相关;光合系统Ⅱ23 kD放氧复合蛋白质是光合系统Ⅱ外周蛋白质中的1个，对光系统Ⅱ放氧活力的维持起重要作用［7－9］。这3个蛋白质在贵州叶片样品中高表达，代表其参与的相应的代谢活动旺盛，提示在贵州气候下生长的烟草叶片糖酵解代谢生产能量高，半胱氨酸合成旺盛以及光合系统Ⅱ的放氧活性较高。有文献报道，不同的气候条件对烟草叶片蛋白质表达影响最大的就是烟叶糖代谢途径、呼吸代谢、光合途径等相关的酶类［10－11］，这与本研究有相同之处。

与之相比，在宝丰烟叶样品中，质体脂质相关蛋白质、乙醇脱氢酶和液泡ATP酶G亚基3个蛋白表达量都高于毕节样品中的表达量，且3个蛋白质均为胁迫诱导蛋白质，质体相关蛋白质也称作原纤维蛋白质，胁迫条件下在茄科植物叶片中会大量积累。液泡ATP酶主要在盐渍、干旱条件下受到诱导且起重要作用，而乙醇脱氢酶更是在各种非生物胁迫条件下如盐、涝、干旱、低温下被诱导表达，主要参与胁迫条件下乙醇酵解途径，通过本身的高表达从而维持乙醇酵解途径的高效进行，以增强植物的抗胁迫能力［12－14］。

有研究表明，植物在温度超过适宜生长温度10～15℃时，即产生热胁迫反应［15］，烟草是温度适应性较强的一种作物，具有较强的地域适宜性，因而种植范围也较广泛，在不同的生态环境中生长的烟草必然具有其内在的适应机制。本研究结果表明，烟草在毕节和宝丰的气候、生态差别较大的环境生长下叶片的蛋白质表达差异较大，烟草生长季宝丰光照充足、雨热同步的气候特点对烟草的生长造成了一定的环境胁迫，从而诱导多个胁迫响应蛋白质大量表达。而毕节烟草生长季光照适中、温湿均衡的气候特点则使得烟草的生长倾向于合成代谢的增强，如能量合成、氨基酸合成以及光合作用的进行。研究结果也说明，不同的气候条件会改变植物体内起主导作用的代谢途径。比如毕节的气候有利于植株的能量及物质的合成代谢，而宝丰的气候则有利于植株的抗性生理代谢。

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