李 新,焦 燕,代 钢,杨铭德,温慧洋 (内蒙古师范大学化学与环境科学学院,内蒙古 呼和浩特 010022)



内蒙古河套灌区不同盐碱程度的土壤细菌群落多样性

李 新,焦 燕*,代 钢,杨铭德,温慧洋 (内蒙古师范大学化学与环境科学学院,内蒙古 呼和浩特 010022)

摘要：采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术对内蒙古河套灌区三种不同盐碱程度土壤(盐土,强度盐化土,轻度盐化土)不同深度(0～20cm和20～30cm)土壤细菌16S rDNA V3～V6 可变区扩增片段进行分析,并对土壤理化性质进行了测定.结果表明:细菌群落多样性随土壤盐碱化程度的加深而减少(轻度盐化土>强度盐化土>盐土),随土壤深度的增加而降低(细菌群落多样性0～20cm土层大于20～30cm土层).细菌Shannon-Wiener指数在轻度盐化土中最大为3.36,在强度盐化土和盐土分别为3.05和2.49.不同盐碱程度土壤以细菌相似系数聚类,分为0～20cm层与20～30cm层两大族群,土壤细菌群落Shannon-Wiener指数在0～20cm层中(盐土为3.04,强度盐化土为3.29,轻度盐化土为3.36)均大于在20～30cm层(盐土为2.49,强度盐化土为3.05,轻度盐化土为3.14).相关性分析和典范对应分析表明,土壤w(EC)、pH值、w(SOC)、w(TP)是土壤细菌群落结构多样性的显著影响因素,不同盐碱程度土壤中细菌群落的Shannon-Wiener指数与土壤w(EC)(r=-0.542,P<0.05)、pH(r=-0.526,P<0.05)呈显著负相关,与土壤w(SOC)(r=0.700,P<0.01)和w(TP)(r=0.805,P<0.01)呈极显著正相关.w(EC)和pH对盐碱土壤细菌群落结构的影响力最大.回收DGGE图谱中20个优势条带进行测序分析,结果显示,变形菌纲(α-变形菌纲、β-变形菌纲、γ-变形菌纲和δ-变形菌纲)是盐碱土壤的主要类群.

关键词：河套灌区；盐碱土壤；细菌；变性梯度凝胶电泳(DGGE)；主成分分析

* 责任作者, 教授, jiaoyan@imnu.edu.cn

土壤微生物是土壤有机组分和生态系统中最活跃的部分,在促进土壤质量和植物健康方面发挥着重要的作用,被认为是最敏感的土壤质量生物学指标[1].土壤微生物多样性指土壤生态系统中所有的微生物种类、它们拥有的基因以及这些微生物与环境之间相互作用的多样化程度.一般认为,土壤微生物多样性存在于基因、物种、种群以及群落等4个层面,是土壤生态系统的一个基本生命特征,也是时间和空间的函数[2-3].国内外对农田、森林、草原的土壤微生物研究较多[4−5],但对盐碱土壤的研究多局限于理化特性的测定分析,国内针对盐碱土壤的微生物研究也仅限于天津滨海区域,江苏滨海盐碱地,松嫩平原,新疆、甘肃[6]等地,康贻军等[7]研究滩涂盐碱土壤微生物生态特征,曹国栋等[8]对扇缘带盐碱土上生长的三种植被类型下的土壤微生物类群数量进行了研究.张广志等[9]在盐碱土壤鉴定出假单胞菌属和黄杆菌属.牛世全等[10]对河西走廊盐碱土细菌种群多样性的16S rDNA研究表明,γ-变形菌为优势菌群.石伟等[11]对极端盐碱土壤细菌的分离筛选及抗盐特性研究也发现多数菌株属于γ-变形菌门.然而,针对内蒙古河套灌区盐碱土壤中的微生物研究数量、种群结构、优势菌系以及盐害与土壤微生物活动之间的生态关系等相关报道较少.

土壤盐碱化已严重制约着内蒙古河套灌区的农业生产,同时对本地区的粮食安全构成了严重威胁[12-13].河套灌区盐碱地面积约4.3×105hm2,巴彦淖尔市占2.4×105hm2,其土壤盐渍化面积与比例如下:轻度盐化面积1.3×105hm2,占52.83%;中度盐化面积7.6×104hm2,占31.94%;重度盐化面积3.6×104hm2,占15.23%[14].

土壤中最活跃生物因子是土壤细菌,它既是土壤微生物的重要组成部分,占土壤微生物总数的70%～90%,也是土壤物质流和能量流的主要推动者,可以直接反映土壤肥力,已被公认为土壤生态系统变化的预警及敏感指标[15-19],在土壤养分循环中起着至关重要的作用.由于从环境样品中分离和培养细菌困难,不经分离培养步骤,直接从土壤中提取总DNA并分析其基因信息的分子生物学方法已被发展用来描述和鉴定微生物群落.近年来基于DNA方法的群落分析如PCR扩增技术、克隆文库法、荧光原位杂交法、限制性酶切片段长度多态性法,变性和温度梯度凝胶电泳法[20],高通量测序技术[21]等得到了迅速的发展其中变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术由于有结果精确、可靠性强、重现率高等优点,已广泛应用于不同生态环境中微生物群落组成、多样性及种群动态变化的研究[22].如谢学军等[23]借助DGGE技术研究了重金属污染物对土壤微生物多样性的影响;Dong等[24]利用DGGE分析方法研究了湿地土壤微生物多样性;Smalla等[25]采用DGGE技术对不同植被根际微生物进行了微生物多样性分析.

土壤耕作层一般疏松多孔,通透性良好,根系集中,而土壤犁底层孔隙度小,通气性差,透水性不良.二者的差异势必会对微生物群落结构等产生影响.该文采用DGGE技术,对内蒙古河套灌区不同盐碱程度不同深度土壤(0～20cm耕作层和20～30cm犁底层)中细菌的群落结构和多样性差异进行分析,探讨土壤理化特性和盐碱化土壤微生物的相互作用机制,对于盐碱地的综合利用与开发具有重要的实践指导意义.

1 材料与方法

1.1 研究区概况

供试土壤采于内蒙古巴彦淖尔市乌拉特前旗,地处黄河北岸,河套平原东端,该地属温带大陆性气候,冬寒而长,夏热而短,干旱少雨,春季风沙较大,极端最高气温为39.7℃ ,最低气温-30.7℃ ,年平均气温7.7℃ .年平均日照3212.5h,无霜期167d.降水集中于7～9月,年平均降水量213.5mm,最大降水量为8月,极端日降水量达109.6mm.

1.2 样品采集

为避免地形等因素影响,研究样区选择平坦地形并按照邻近原则布置.试验于2014年5月未种植作物前(前茬季节作物葵花)选取3种不同盐碱程度的盐碱土壤,样地S1、S2和S3(10m×10m)采用“S”型布点法采集样方在距离地表0～20cm和20～30cm用土钻分层取样,每个样方设10个样点(1m×1m).各采样点重复取样3次,并将3次所得土壤样品充分混匀,将可见的植物残体(如根、茎和叶)和土壤动物去除,装于无菌聚乙烯自封袋中.一份风干磨碎过2mm筛用于测定土壤理化特性,另一份迅速运回实验室,然后将部分土样分装于若干无菌离心管中-80℃保存.试验土壤样地基本情况见表1.

表1 不同土壤盐分含量(%)Table 1 Salt content in different types of soil in Hetao irrigation area (%)

1.3 土壤盐碱程度分析

内蒙古河套灌区地处干旱、半干旱区,该研究三种土壤的含盐总量依次为S1(1.69%)>S2(0.83%)> S3(0.12%),S1,S2和S3都是SO42-和Cl-含量最多,见表1,结合土壤盐化分级标准(表2)可知,S1土壤为盐土,S2土壤为强度盐化土壤,S3为轻度盐化土壤.

表2 土壤盐化分级指标[26]Table 2 Soil salinization classification index[26]

1.4 样品分析

1.4.1 样品理化性质测定 pH值以1:2.5土水比用复合电极测定;电导率(EC)以1:5土水比用复合电极测定;土壤容重的测定用环刀法;土壤质地用比重计速测法;土壤有机碳(SOC)用重铬酸钾容量法-外加热法;土壤全磷(TP)用HClO4-H2SO4测定,土壤全氮(TN)用凯氏定氮法.土壤盐分:碳酸根、重碳酸根离子测定用电位滴定法;氯离子测定用硝酸银滴定法;硫酸根离子测定用EDTA容量法;钙、镁离子测定用EDTA容量法;钾、钠离子测定用火焰光度法.理化性质具体测定方法按照《土壤农化分析(第三版)》进行[27].1.4.2 土壤总DNA的提取及细菌16S rDNA片段的PCR扩增 分别取0.5g土样样品,采用土壤DNA提取试剂盒(E.Z.N.A®.Soil DNA kit, Omega, USA)提取土壤总DNA.以样品基因组DNA为模板,采用细菌通用正向引物338F在5‘末端加40个碱基的GC夹: 5c-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G ACTCCTACG GGA GGC AGC AG-3‘;和反向引物是518R:5‘-ATT ACC GCG GCT GCT GG –3’,40个GC夹加到338F前面,以保证DGGE实验的稳定和片断的分离,这一对引物能够扩增绝大多数的细菌.

PCR扩增体系(50µL):10×PCR buffer 5µL; dNTP(2.5mmol/L)3.2µL;rTaq(5U/µL)0.4µL;GC-3 38F(20µmol/L)1µL;518R(20µmol/L)1µL;模板DNA 50ng;补ddH2O至50µL.PCR扩增程序:94℃预变性5min;94℃变性1min,55℃复性45s,72℃延伸1min,30个循环;最终72℃延伸10min.PCR产物采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit纯化回收.PCR仪为Biometra公司生产的T-gradient,凝胶成像仪为Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝胶成像系统.

1.4.3 PCR产物的变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析 取10µL PCR的产物进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析.采用变性梯度为35%～55%、浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶(化学变性剂为100%尿素7mol/L和40%(V/V)的丙烯酰胺)在1×TAE缓冲液中150V 60℃下电泳5h.变性梯度凝胶电泳(DGGE)完毕后、采用银染法染色、步骤如下:首先固定液(乙醇50mL、冰醋酸2.5mL、定容500mL)固定15min;Milli-Q纯水清洗、20s和2min各一次;其次银染液(硝酸银1g、37%甲醛0.75mL、定容500mL)染色15min;Milli-Q纯水清洗、20s和2min各一次;再次显色液(氢氧化钠7.5g、37%甲醛2.5mL、定容500mL)显色5-7min;最后用终止液(乙醇50mL、冰醋酸2.5mL、定容500mL)终止反应.

1.4.4 DGGE图谱中优势条带的回收与测序用灭菌的手术刀切下待回收DGGE条带,采用OMEGA公司Poly-Gel DNA Extraction Kit回收目的条带.以2 µL回收产物为模板,338F/518R为引物进行PCR扩增.PCR扩增体系(50 µL) 为:10×PCR buffer 5µL;dNTP(2.5mmol/L)3.2µL; rTaq(5U/µL)0.4µL;338F(20mmol/L)1µL;518R(20 mmol/L)1µL;模板DNA 1µL;补ddH2O至50µL.PCR扩增程序为:94℃预变性4min;94℃变性30s,55℃复性30s,72℃延伸30s,30个循环;最后,72℃延伸10min.将重新扩增的DNA片段切胶回收、纯化后,连接到Pmd18-T载体上,并转化至DH5α感受态细胞中,筛选阳性克隆,进行序列测定.

1.5 数据分析方法

采用SPSS 22.0统计软件进行方差分析.细菌多样性指数是研究群落物种数和个体数以及均匀度的综合指标.根据电泳图谱中样品条带数目及每个条带的强度(灰度),对各样品中细菌多样性指数(Shannon-Wiener,H)、均匀度(Evenness, E)和丰富度(Richness,S)等指标进行分析.DGGE图谱采用Quantity one软件对每个样品的电泳条带数目、条带密度进行数字化分析,多样性指数(H)、丰富度指数(S)和均匀度指数(E)等指标被用来比较不同样品的多样性情况.其算法如下所示:

式中:pi为样品中单一条带的强度在该样品所有条带总强度中所占的比率;N为DGGE图谱单一泳道上所有条带的丰富度;Ni为第i条带的丰富度;S是某样品中所有条带数目总和.测序结果采用DNAstar和Cluster软件进行序列分析,下载最相似的菌株序列作为系统发育树的参考序列.然后采用MEGA软件,Neighbor-joining法构建系统发育树,自展数(bootstrap)为1000.利用Canoco for Windows 4.5软件进行细菌群落和理化因子的典范对应(canonical correspondence analysis CCA)分析.

2 结果与分析

2.1 土壤细菌群落多样性分析

2.1.1 土壤细菌群落DGGE图谱 经凝胶电泳检测,选取较高质量土壤样品细菌基因组DNA.各样品的PCR扩增产物经纯化后进行细菌的DGGE电泳见图1,利用Quantity One软件对DGGE胶图进行条带识别和图谱分析,结果显示,土壤样品微生物的16S rDNA片段通过DGGE被分离出不同位置的若干条带.根据胶图上条带迁移的位置和数目可以看出细菌的种类丰富程度.样品间的主要条带不同,表明细菌优势种存在差别.不同泳道同一位置条带的明暗程度(光密度值)则反映该细菌类群在不同环境样品中的相对丰度[28].不同土壤样品在细菌种类组成上差别明显.

盐土、强度盐化土和轻度盐化土的表层(0～20cm)土壤中,对应的泳道有许多相同的条带,表明这些相同的条带所代表的细菌种群为不同程度盐碱地群落的表层土壤所共有,但是这些共有条带的亮度不尽相同,表示它们在各自盐碱地群落表层土壤中的丰富度存在差异.此外,强度盐化土和轻度盐化土细菌群落的表层土壤有一些条带,在盐土中却未见,说明强度盐化土和轻度盐化土表层土壤细菌群落与盐土细菌群落有显著差异,可能是盐胁迫抑制了这些细菌的生长.相反,盐土表层土壤中又有个别几种细菌种群是其特有的,这可能与盐土土壤中嗜盐或耐盐微生物有关.在20～30cm层土壤中,不同盐碱程度土壤类型间的泳道条带变异较大,轻度盐化土细菌种群较盐土和强度盐化土少.同一盐碱程度土壤在不同土壤深度的泳道条带比较,可以看出各自的优势条带明显,说明优势种群发生了变化.

图1 不同盐碱程度不同土壤深度细菌群落DGGE图谱Fig.1 DGGE fingerprint of bacteria from different soil layers in different saline-alkaline soil

图2 不同盐碱程度不同深度土壤细菌群落聚类分析Fig.2 The cluster analysis of bacterial community from different soil layers in different saline-alkaline soil数值代表各泳道与1泳道相比的相似性

2.1.2 不同盐碱程度不同深度土壤细菌群落相似性分析 依据样品间的相似系数构建的聚类图(UPGMA),如图2所示.15个土壤样品中,细菌群落组成总体分为两大族群,3种类型盐碱土0～20cm层土壤细菌聚为一族群,20～30cm层土壤细菌聚为另一族群.说明0～20cm层与20～30cm层土壤细菌种群的构成变化较大.其中,0～20cm层土壤细菌又可分成两大族群,盐土0～20cm层的3个重复土壤细菌聚为一族群,强度盐化土和轻度盐化土土壤细菌聚为另一族群.这说明盐土的土壤细菌种群不同于强度盐化土和轻度盐化土的细菌种群.强度盐化土中5#和6#的相似度为0.66,轻度盐化土中8#和9#的相似度达0.61.一般认为相似值高于0.60的两个群体具有较好的相似性[27].强度盐化土和轻度盐化土0～20cm层细菌,他们的相似系数仅为0.43,说明强度盐化土与轻度盐化土细菌种群结构存在很大差异.

2.1.3 土壤细菌群落多样性指数分析 不同盐碱程度不同深度土壤细菌群落多样性指数如表3所示.不论在0～20cm层还是20～30cm层土壤中,轻度盐化土和强度盐化土的细菌Shannon-Wiener指数和Richness均为最大,并且与盐土有显著性差异.说明轻度盐化土和强度盐化土不论在0～20cm层还是20～30cm层土壤中细菌群落都最为丰富,但其中各菌种分布的Evenness差异不显著;随着土壤深度的增加,Evenness不变,Shannon-Wiener指数和Richness指数均呈显著降低.这表明从土壤0～20cm层至30cm的深度范围内,随着土层深度的增加,土壤细菌的Shannon-Wiener指数越小,Richness越低.

表3 不同盐碱程度不同深度土壤细菌群落多样性指数分析Table 3 Analysis of bacterial genetic diversity in different soil layers in different saline-alkaline soil

2.1.4 土壤细菌群落系统组成分析 DGGE凝胶条带回收后,以338F/518R为引物进行PCR扩增,获得约200bp的DNA片段.PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体上,转化至DH5α感受态细胞中,筛选阳性克隆测序.测序结果与GenBank中的序列进行比对,得到条带所代表的细菌类型.每个回收条带选取3个克隆进行了序列测定,如表4.根据这些DGGE带谱所代表的微生物即可判定不同盐碱程度土壤不同土层细菌群落的组成状况.

条带Band4在轻度盐化土0～20cm条带多,属于固氮弓菌属(Azoarcus)为轻度盐化土0～20cm层特有的优势菌.条带Band11和Band36在盐土0～20cm条带多,属于黄杆菌属(Flavobacterium)为盐土0～20cm层特有的优势菌.条带Band23属于纤维弧菌属(Cellvibrio),条带Band27属于食碱菌属(Alcanivorax),在3种不同程度盐碱土0～20cm层都有出现.条带Band3属于Rhodoligotrophos appendicifer为盐化土20～30cm特有的优势菌.一般情况下认为,两种细菌16S rDNA 序列同源性小于98%时属于不同种,而同源性小于93%～95%时,则属于不同的属[28].所以条带Band8、18、28、37、38和43属于新菌的可能性比较大.

将获得的20条序列通过BLAST比对分析后,由表5可知,大致可分为5个大的细菌系统发育类群,即变形菌门(Proteobacterium)、蓝藻门(Cyanophyta)、绿弯门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)系统.其中,变形菌门的12个条带中有7个(Band1、12、15、19、23、24和27)在3种不同盐碱度土壤0～20cm和20～30cm都出现,属于γ-变形菌纲(γ-proteobacteria),它是变形菌门最大的亚群,也是盐碱土壤中的优势类群;3个(Band3、6、34)属于α-变形菌纲(α-Proteobacteria),1个(Band4)属于β-变形菌纲(β-proteobacteria),1个(Band39)属于δ-变形菌纲(δ–Deltaproteobacteria).γ-变形菌纲包括假单胞菌属、纤维弧菌属和食碱菌属, α-变形菌纲包括Rhodoligotrophos appendicifer属、新鞘脂菌属和鞘脂单胞属,β-变形菌纲包括固氮弓菌属,δ-变形菌纲包括脱硫弧菌属.蓝藻门包括Crocosphaera watsonii属,绿弯门包括Roseiflexus castenholzii,拟杆菌门包括黄杆菌属和海藻菌属,放线菌门包括Planobispora siamensis属、库茨勒菌属和血杆菌属.变形菌门(α-变形菌纲、β-变形菌纲、γ-变形菌纲和δ-变形菌纲)是盐碱土壤的主要类群.DGGE测定盐碱土壤中的菌株大部分都是属于耐盐碱的细菌菌株.

表4 测序克隆序列与其GenBank最相似序列的比对结果Table 4 Comparison between determined clone sequence and its most similar sequence in GenBank

2.2 土壤理化特性对细菌群落结构影响

2.2.1 不同盐碱程度不同深度土壤理化特性 由表5可知, 3种不同盐碱度不同深度的土壤, w(EC)、pH值、w(TN)、w(TP)、w(SOC)、土壤水分和土壤容重的含量均存在差异.同一土壤深度,3种不同盐碱程度土壤的pH和w(EC)表现为盐土最大,并且与轻度盐化土和强度盐化土有显著差异.土壤容重、w(SOC)、w(TP)和w(TN)表现为:盐土<强度盐化土;同一盐碱程度土壤,不同土壤深度,土壤水分、w(EC)、土壤w(SOC)、w(TP)和w(TN)表现为:0～20cm层含量高于20～30cm层含量,与土壤容重变化趋势相反.pH值在0～20cm层和20～30cm层土壤中则无明显规律.

表5 不同盐碱程度不同深度土壤理化参数Table 5 The physical and chemical properties of different soil layers in different saline-alkaline soil

2.2.2 相关性分析 表6为0～20cm层与20～ 30cm层土壤细菌群落基因型多样性Shannon-Wiener 指数,Evenness和Richness指数与表5七种理化参数的相关性分析结果.由表6可见,3种不同盐碱程度土壤细菌群落的Shannon-Wiener指数与Richness都与土壤w(EC)、pH值呈显著负相关,与土壤w(SOC)、w(TN)和 w(TP)呈极显著正相关.Evenness指数与土壤土壤水分和w(TN)呈显著正相关.w(EC)、pH值越小,土壤w(SOC)、w(TN)和w(TP)越大,土壤细菌群落的Shannon-Wiener和Richness指数越大.

表6 不同盐碱程度不同深度土壤细菌群落指数与理化参数的相关性分析Table 6 Pearson correlation analysis between different soil layers in different saline-alkaline soil bacterial community indices and physicochemical parameters

图3 不同盐碱程度不同深度土壤细菌群落-环境CCA排序Fig.3 CCA biplot of samples and environmental variables1～3:盐土0～20cm深度土壤3个平行样,4～6:强度盐化土0～20cm深度土壤3个平行样,7～9:轻度盐化土0～20cm深度土壤3个平行样;10、11:盐土20～30cm深度土壤2个平行样,12、13:强度盐化土20～30cm深度土壤2个平行样,14、15:轻度盐化土20～30cm深度土壤2个平行样

2.2.3 土壤细菌和理化性质的CCA分析 将DGGE图谱中各条带的灰度值作为物种数据,利用CANOCO进行去趋势对应分析(DCA),所得结果中第1排序轴的梯度长度值为2.012,当该值介于1.5～3.0时,选择线性模型做冗余分析(RDA)或者选择单峰模型做典范对应(CCA)分析均合适.根据Legendre[31]分析理论,由于典范对应分析(CCA)每一步计算结果都可以和环境因子进行回归,CCA排序能够很好地反应物种在特征因子梯度上的分布,因此选择CCA更合适.将物种数据与0～20cm,20～30cm土壤理化参数w(EC)、pH值、w(TP)、w(TN)、w(SOC)、土壤水分w(W)和土壤容重做CCA,第1排序轴和第2排序轴解释了土壤细菌群落的21.3%和15.5%,总排序轴即所选的土壤环境理化因子对物种的总解释量为81.7%,损失的信息只有18.3%.这说明土壤w(EC)、pH值、w(TP)、w(SOC)、土壤水分和土壤容重在研究盐碱土土壤中的重要性.然而在盐碱土壤中环境中可能还有其他理化因子对细菌群落结构产生影响.

图3为不同盐碱程度不同深度土壤细菌群落土壤-环境CCA排序图.第1排序轴与w(EC)、pH值呈负相关,相关系数分别为-0.7695、-0.7038,说明横坐标从左到右w(EC)、pH值逐渐降低;第1排序轴与土壤容重呈正相关,相关系数为0.7637,说明从左到右土壤容重逐渐增大.第2排序轴与w(SOC)、w(TN)和w(TP)呈正相关,相关系数分别为0.8871、0.8304和0.9659,说明纵坐标从下至上w(SOC)、w(TN)和w(TP)逐渐增大.w(EC)、pH值和土壤容重是影响盐碱土壤中细菌群落结构的主要影响因子.由图3可见,在0～20cm和20～30cm土层3种不同盐碱程度土壤的分异明显,而且各土壤平行样一致性较好,均聚集在一起.w(EC)和pH值环境变量的长度都长于其他理化因子,也说明其在盐碱土壤中对细菌群落的影响力最大.样方垂直投影于射线上,沿着变量箭头方向环境变量值增大.轻度盐化土和强度盐化土0～20cm的细菌群落适宜在高w(SOC)、w(TN)和w(TP)中生存,盐土0～20cm的细菌群落适宜在高w(EC)、pH值生存.在20～30cm土壤中,轻度盐化土中的细菌群落在土壤容重较大时适宜生存.

CCA分析结果表明,Monte Carlo测试的所有成分轴P <0.01,w(EC)、pH和土壤容重对盐碱土壤的细菌群落存在显著影响,并且w(EC)、pH值和土壤容重对盐碱土壤细菌群落的影响力最大.

3 讨论

在自然生态环境下的许多微生物不适宜在实验室培养,因此用传统的方法如平板计数法得到的微生物多样性结果是非常片面的[32];碳素利用法(Biolog系统)仅能鉴定快速生长的部分微生物,只反应了潜在的而不是原位的代谢多样性[33];而以PCR-DGGE技术为代表的分子生态学方法,因为无需培养且检验时间较短,相对较为先进和可靠.PCR-DGGE能很好的揭示不同程度盐碱土壤中相关细菌较高的种群多样性、遗传多样性和生态多样性.

3.1 不同盐碱程度土壤对细菌群落结构的影响

利用PCR-DGGE的研究方法得出,河套地区盐碱土壤,在0～20cm层和20～30cm层土壤中,盐土和强度盐化土、轻度盐化土细菌群落种类之间差异显著.随着盐碱化程度的加深,土壤细菌群落的Shannon-Wiener指数和丰富度指数都显著性降低.这与孙佳杰等[34]研究一致,土壤盐化程度越高,土壤微生物数量越少,土壤微生物中细菌的数量从大到小依次为轻度盐化土、中度盐化土、重度盐化土、盐土.本研究表明,土壤中细菌群落的Shannon-Wiener指数与Richness随土层深度的增加而显著降低.潘雪莲等[35]研究表明, 在0～30cm土壤深度范围内,黄土高原微生物多样性指数随土层深度的增加而减少;张社奇等[36]在研究黄土高原刺槐林地土壤微生物垂直分布时发现土壤细菌群落对深度的变化极为显著.

3.1.1 土壤盐度和碱度对土壤对细菌群落结构的影响 土壤中盐碱程度的加深主要表现为土壤盐分的增加和pH值升高.相关性分析表明,3种不同盐碱程度的土壤中细菌群落的Shannon-Wiener指数与Richness与土壤w(EC)、pH值呈显著负相关.土壤盐碱程度加深意味着土壤w(EC)和pH值越高,土壤细菌群落的多样性和丰富度越低.土壤水溶性离子总量(简称土壤全盐量)是衡量土壤盐害程度大小的重要指标,土壤水溶性离子又是强电解质,其导电能力可用电导率w(EC)表示,并且二者具有正相关性,所以土壤w(EC)越高,盐分越高,盐害程度越严重[37].土壤微生物对w(EC)变化十分敏感,当土壤盐分升高时,盐分胁迫直接改变了微生物的生存环境,造成土壤微生物渗透胁迫,抑制和降低土壤活性微生物种群数量[38].李新等在利用PLFA方法研究盐碱土壤微生物时发现,土壤盐害程度越高,碱性越强土壤主要微生物多样性越单一,反之则越丰富[39].康贻军等[7],Yu等[40]指出,细菌数量与土壤全盐含量呈显著负相关,土壤盐害程度越高,微生物数量越少,土壤细菌和真菌的数量分布从大到小为轻度盐化土、中度盐化土、重度盐化土和盐土.许多研究证明,在多种生态系统中pH通常与细菌群落结构有很好的相关性[41−42].

3.1.2 土壤有机碳、全磷等理化性质对土壤细菌群落结构的影响 3种不同盐碱程度的土壤中细菌群落的Shannon-Wiener指数与Richness都与土壤w(SOC)和w(TP)呈极显著正相关,与土壤容重呈显著负相关.即土壤盐碱程度越低,土壤w(SOC)和w(TP)越高,土壤细菌群落的多样性和丰富度也越高.这与许多学者研究一致,随着盐碱程度的增加,土壤养分含量逐渐下降,N、P等含量明显降低[43-46].水分条件是影响土壤中微生物生存和活性的一个重要因素,适当的土壤水分条件可以增加土壤微生物量和微生物活性[47].Griffiths等[48]研究指出,水分能明显调节草地微生物多样性,并会增加微生物本身对水的抗受性.而该研究表明,土壤水分w(W)与细菌Evenness指数呈显著正相关,和Shannon-Wiener指数并不存在相关关系,可能与微生物在河套灌区这种极端干旱和盐碱胁迫的条件下,已经适应了缺水的环境,土壤中的其他营养成分成为限制微生物活动的主要因子.

3.2 主要土壤细菌类群的分析

DGGE条带经序列测定后发现,不同盐碱程度土壤不同深度的优势菌群不同.变形菌门细菌(α-变形菌纲、β-变形菌纲、γ-变形菌纲和δ-变形菌纲)、拟杆菌门(黄杆菌属)和绿弯门(玫瑰弯菌属)在不同盐碱度土壤中均有分布.张广志[9]在盐碱土壤中分离鉴定耐盐细菌时发现了黄杆菌属和假单胞菌属,并且在盐浓度高达25%时,也能生存.有研究发现,假单胞菌属细菌是一种耐盐碱菌群,大多数种不需要有机生长因子,同时还可降解环境中广泛存在的多种有机分子,在自然界和污染环境的矿化修复作用过程中有着重要地位.硫弧菌属最适生长温度在25～30℃,是硫酸盐还原细菌,主要以硫酸盐或其他的氧化态硫化物作为呼吸链的末端电子受体,以氢气为电子受体,还原产物硫化氢.玫瑰弯菌属(Rosebacter Shiba)是一种在碱性热温泉中发现的细丝状不产氧光合细菌[50].食碱菌属只有在相对高碱性和高盐量的盐土和强度盐化土0～20cm层分布.刘艳等[51]研究深海热液区微生物对深海环境响应机制时也发现了食碱菌属,并证明了食碱菌属具有适应高温和大量硫的代谢特征.鞘脂单胞菌属大部分是鞘氨醇单胞菌,存在于轻度盐化土0～30cm,盐土和强度盐化土的20～30cm层.它们能广泛的生存在各种水体、大气、土壤甚至地球上的极端环境中.它们还能降解比较复杂的大分子有机物,也能产生有价值的高分子,还能利用简单的小分子在极端贫瘠的环境中存活[52].

综上可知,不同盐碱土壤中的主要细菌都是耐盐碱的细菌菌株.变形菌纲(α-变形菌纲、β-变形菌纲、γ-变形菌和δ-变形菌纲)是盐碱土壤的主要类群.在所有测序条带中,变形菌门占分析样品总量的55%,其余为拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteria)和蓝藻门.牛世全等[8]对河西走廊盐碱土细菌种群多样性的16S rDNA研究发现,原生盐碱土中存在9大细菌类群,γ-变形菌为优势菌群.石伟[11]对极端盐碱土壤细菌的分离筛选及抗盐特性研究显示多数菌株属于γ-变形菌纲(γproteobacteria).该研究表明内蒙古河套灌区盐碱土壤细菌具有丰富物种、遗传和发育系统多样性.16S rDNA序列分析技术能够在属以上水平很好的反应细菌的分类.利用现代分子生物学技术分析细菌结构的基础上,进一步对土壤微生物区系及其相互协同拮抗的代谢机制、以及与盐碱环境之间的关系将成为今后研究的重点.

4 结论

4.1 内蒙古河套灌区盐土、强度盐化土和轻度盐化土分别在0～20cm层和20～30cm层土壤细菌群落差异显著,土壤盐碱化程度越低,土壤细菌群落多样性和丰富度越高,表现为轻度盐化土>强度盐化土>盐土;0～20cm层与20～30cm层的土壤细菌群落也存在显著性差异,随着土层的加深,土壤细菌群落多样性和丰富度减小.

4.2 CCA分析表明, w(EC)、pH和土壤容重对盐碱土壤细菌群落结构的影响力最大.相关分析表明,土壤pH值、w(EC)越低,土壤w(SOC)、w(TN) 和w(TP)越高,土壤细菌群落的多样性和丰富度也越高.

4.3 变形菌门(α-变形菌纲、β-变形菌纲、γ-变形菌纲和δ-变形菌纲)是盐碱土壤的主要类群.盐碱土壤中的菌株大部分都是属于耐盐碱的细菌菌株.

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Soil bacterial community diversity under different degrees of saline-alkaline in the Hetao Area of Inner Mongolia.

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Abstract：Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) based on analyzing V3～V6 variable regions of bacterial 16S rDNA, were used to examine the microbial community structure and diversity in different saline-alkaline soils (saline soil, strongly salinized soil and slight salinized soil) and soil depths (0～20cm, 20～30cm) in the Hetao Area of Inner Mongolia.Their physical and chemical properties were measured, respectively.Experimental results showed that bacterial community structure and diversity decreased with the different saline-alkaline soil (slight salinized soil> strongly salinized soil> saline soil)and declined with soil depths (0～20cm>20～30cm).Shannon-Wiener index of bacterial community in slight salinized soil was the highest value (3.36), while it was only 3.05 and 2.49 in strongly salinized soil and saline soil.The cluster analysis of DGGE bands showed that the bacterial community structure and diversity formed two distinct clusters 0～20cm and 20～30cm.Shannon-Wiener index of bacterial community in 0～20cm layer (saline soil 3.04, strongly salinized soil 3.29, slight salinized soil 3.36) were higher than 20～30cm layer (saline soil2.49, strongly salinized soil 3.05, slight salinized soil 3.14).Analyses of Pearson correlation and CCA revealed that variations of bacterial community structure were mainly affected by contents of w(EC), pH, w(SOC), w(TP).The soil bacteria diversification index has a negative correlation with the w(EC)(r=-0.542,P<0.05)、pH(r=-0.526,P<0.05), and bacterial community diversity exhibited very significant positive correlation with w(SOC)(r=0.700,P<0.01) and w(TP)(r=0.805,P<0.01).w(EC) and pH were the the greatest influence in saline-alkaline soils.Twenty bands were excised from the DGGE gel and re-amplified for 16S rDNA sequencing.Based on the sequencing results, eleven bands can be identified as related to Proteobacteria.These results provide evidence that Proteobacteria are the domain bacterial communities in different saline-alkaline soilsbook=250,ebook=253of Hetao Area of Inner Mongolia.Saline-alkali soils were mostly bacterial strains belonging to tolerant salty.

Key words：Hetao Area；saline-alkaline soils；bacterial；DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis); principal component analysis

中图分类号：X172

文献标识码：A

文章编号：1000-6923(2016)01-0249-11

收稿日期：2015-05-18

基金项目：国家自然科学基金项目(41165010,41375144,41565009);2013内蒙古高等学校“青年科技英才”支持计划资助(NJYT-13-B06);内蒙古师范大学研究生科研创新基金项目(CXJJS13044)

作者简介：李 新(1987-),女,内蒙古乌兰浩特人,在读硕士研究生,主要从事土壤微生物多样性研究.