李婉婉，魏少鹏，姬志勤

(西北农林科技大学 植物保护学院，陕西杨凌　712100)



小麦赤霉病菌代谢物 Integracide A抗菌除草活性研究

李婉婉，魏少鹏，姬志勤

(西北农林科技大学 植物保护学院，陕西杨凌712100)

摘要为明确小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)农药活性代谢物的结构及其抗菌除草活性。采用乙酸乙酯提取、凝胶柱层析及反相高效液相色谱分离技术获得该代谢物高纯度活性化合物，采用核磁共振波谱和多级质谱等技术鉴定其化学结构；采用菌丝生长速率法、微量稀释法和平皿法测定该代谢物的抗真菌、抗细菌和除草活性。结果表明：活性化合物鉴定为四环三萜类抗生素-integracide A，其对烟草青枯病菌(Pseudomonas solanacearum)有强烈的抑菌活性，最低抑菌质量浓度(MIC)为6.25 mg/L；对反枝苋(Amaranthus retroflexus)种子萌发和根生长有强烈的抑制作用，抑制中浓度(EC50)分别为13.20 mg/L和3.46 mg/L。小麦赤霉病菌代谢物integracide A具有较强的抑菌和除草活性。

关键词小麦赤霉病菌；Integracide A；抑菌活性；除草活性

小麦赤霉病是温暖潮湿麦区广泛发生的一种毁灭性病害[1-2]，赤霉病的发生不仅导致小麦严重减产，而且病菌产生的毒素可影响人畜的健康安全[3]。近年来，小麦赤霉病的发生面积约占全国小麦种植总面积的1/4，该病是中国小麦最严重的病害之一[4-5]。目前，对小麦赤霉病的防治主要是在扬花期喷洒多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂进行化学防治[6-7]。近几年，国内对小麦赤霉病菌代谢物的研究主要集中在毒素方面，刘新琼[8]研究发现小麦赤霉病粗毒素对小麦胚根生长有一定的影响。国内对小麦赤霉病菌代谢物以及其作用的研究较少，而国外在该方面的研究相对较多，主要集中在医学方面。1996年Bill等[9]对小麦赤霉病菌代谢物分离发现一种代谢物有抗HIV的作用，同时，对反枝苋(Amaranthusretroflexus)有较强的种子萌发和根生长抑制作用。为寻找小麦霉病菌农药活性成分，本试验对其次级代谢产物进行提取、分离、结构鉴定及农药活性评价。

1材料与方法

1.1材 料

1.1.1供试菌株发酵菌株：小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)由西北农林科技大学植物病理研究室提供，农药研究所保藏(保藏号：NYS-XC)。

病原真菌菌株：茄子黄萎病菌(Verticilliumdahliae，NYS-QH)、玉米弯孢病菌(Curvularialunata，NYS-YW)、烟草赤星病菌(Alternariaalternata，NYS-YC)、苹果炭疽病菌(Colletotrichumgloesporioides，NYS-PT)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum，NYS-XK)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea，NYS-FH)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum，NYS-YJ)，以上植物病原真菌由西北农林科技大学植物病理研究室提供，农药研究所保藏。将病原真菌接种于PDA培养基，于25 ℃下培养3～7 d。

病原细菌菌株：烟草青枯病菌(Pseudomonassolanacearum，NYS-YQ)、猕猴桃溃疡病菌(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，NYS-MK)由西北农林科技大学农药研究所提供、保藏。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis，CGMCC 1.88)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus，CGMCC 1.1846)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，CGMCC 1.2031)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus，CGMCC 1.189)、大肠埃希氏菌(Escherichiacoli，CGMCC 1.1574)，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。将病原细菌接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，于37 ℃下培养1 d。

1.1.2供试植物小麦(Triticumaestivum)、稗草(Echinochloacrusgalli)、油菜(Brassicanapus)和反枝苋(Amaranthusretroflexus)，由西北农林科技大学农药研究所提供、保藏。

1.1.3试剂和仪器ZHWY-C2112F恒温摇床，上海智诚分析仪器制造有限公司；Bruker DRX 500核磁共振仪(氘代试剂为DMSO)，德国布鲁克公司；WPR熔点仪，上海精科公司；高效液相色谱仪(LC6000)，具UV检测器(LC3000)，北京创新通恒科技有限公司；Finnegan LCQ Advantage MAX高效液相色谱-质谱联用仪，配有ESI电离源和离子阱质量分析器(HPLC-ESI-MS/MS)，美国热电公司；乙醇、乙酸乙酯等均为市售分析纯产品。对照药剂、氨苄青霉素钠(USP级)购自上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2试验方法

1.2.1活性成分提取、分离及结构鉴定10 L发酵液用双层纱布过滤，取菌丝体，置阴凉处通风晾干，得35 g菌丝体；将菌丝体用剪刀剪碎后置入250 mL圆底烧瓶，加入100 mL乙酸乙酯回流提取3次，每次3 h，合并提取液，减压浓缩得1.8 g浓缩物。浓缩物用5 mL甲醇溶解，经凝胶柱层析(Sephadex LH-20，瑞典Amersham Biosciences公司)和反相高效液相色谱(色谱条件：Hypersil ODS2 C18 30 mm×300 mm，10 μm；流动相V(甲醇)∶V(水)=80∶20；流速15.0 mL/min)纯化，得0.97 g活性化合物CM01。采用核磁共振谱及多级质谱技术对其进行结构鉴定。1.2.2抑菌活性评价参照《农药室内生物测定试验准则》中的抑制菌丝生长法评价化合物对供试真菌的抑菌活性[10]。参照美国国家临床实验室标准委员会的微量稀释法测定化合物对供试病原细菌的抑菌活性[11]。

1.2.3除草活性评价采用平皿法测定化合物对供试作物的除草活性[10-11]。

2结果与分析

2.1小麦赤霉病菌代谢物活性成分分离及结构鉴定

根据1H和13C NMR及ESI-MS，并结合相关文献[12-13]，将化合物CM01鉴定为integracide A(图1)，具体理化数据如下。

图1　Integracide A的化学结构

Integracide A，黄色片状结晶。熔点：176.3～177.5 ℃；UV(甲醇) λmax：248 nm。1H NMR(DMSO-d6, 500MHz) δ 5.51(brs, 1H), 5.39(d,J=5.5 Hz, 1H), 5.31(s, 1H), 4.97(s, 1H), 4.71(s, 1H), 4.66(s, 1H), 4.09(m, 1H), 3.78(dt,J=11.0, 4.0Hz, 1H), 3.59(d, J=10.0 Hz, 1H), 2.26～2.50(m, 3H), 2.18～2.23(m, 2H), 2.04～2.11(m, 2H), 1.97(s, 3H), 1.84～1.91(m, 2H), 1.67～1.71(m, 1H), 1.51～1.64(m, 3H), 1.20(s, 3H), 1.06～1.13(m, 3H), 0.97～1.00(m, 12H), 0.85(d,J=6.0 Hz, 3H), 0.77(s, 3H);13C NMR(DMSO-d6, 125MHz) δ 170.3, 156.2, 147.5, 139.9, 124.2, 120.6, 107.0, 88.5, 78.2, 67.9, 67.3, 50.7, 49.0, 46.9, 43.8, 40.5, 37.7, 35.3, 34.4, 33.6, 33.2, 30.9, 29.1, 26.6, 23.1, 22.3, 22.1, 21.4, 18.3, 18.2, 17.9, 17.0;ESI-MS(负离子模式):m/z593 [M-H]-;ESI-MS/MS(%):m/z533(100), 503(20), 435(10), 421(75), 407(35), 393(25)(图2)，可能的裂解途径如图3所示。

2.2小麦赤霉病菌代谢物抑菌活性

抑制真菌菌丝生长活性结果表明(表1)，在供试质量浓度(50 mg/L)下，integracide A对茄子黄萎病菌、玉米弯孢病菌、烟草赤星病菌和苹果炭疽病菌有明显的抑制作用，其菌丝生长抑制率分别为78.1%，66.4%，52.5%和67.2%。毒力测定结果表明(表2)，integracide A对茄子黄萎病菌、玉米弯孢病菌、烟草赤星病菌和苹果炭疽病菌菌丝生长的最低抑菌质量浓度值(MIC)分别为34.90、37.77、51.64和39.08 mg/L。

图2　Integracide A的电喷雾质谱图(负离子模式)

图3　 Integracide A电喷雾质裂解途径

抑制细菌活性结果表明(表3)，integracide A对烟草青枯病菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌有较强的抑菌活性，其MIC值分别为6.25、12.5、6.25和12.5 mg/L。化合物integracide A对猕猴桃溃疡病菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希氏菌没有明显的抑制作用。

表1　 Integracide A对供试病原真菌菌丝生长的抑制作用

表2　Integracide A对供试病原真菌菌丝生长的毒力

注：x为浓度对数；y为抑制率的机率值，表4同。

Note：xis logarithm of concentration;yis the problit value of inhibition.The same as table 4.

表3　 Integracide A对供试病原细菌的最低抑菌质量浓度

2.3小麦赤霉病菌代谢物除草活性

分别以小麦和稗草为单子叶植物代表，油菜和反枝苋为双子叶植物代表，采用平皿法测定integracide A的除草活性。结果表明，integracide A在100 mg/L质量浓度下对小麦、稗草和油菜种子萌发及根生长无明显的抑制作用，但对反枝苋种子萌发及根生长有强烈的抑制作用。毒力测定结果表明(表4)，integracide A对反枝苋种子萌发的抑制中浓度(EC50)为13.20 mg/L，对根生长的EC50为3.46 mg/L。

表4　Integracide A对反枝苋的除草活性

3讨 论

Integracide A是Brill等[9]1996年从土壤微生物镰刀菌(Fusariumcompactumsp.)中分离获得。目前，关于integracide A及其类似物的生物活性主要集中在抗HIV方面，农药活性方面的研究报道较少[12-17]。Brill等[9]测定integracide A对动物致病真菌的抑菌活性，在100 mg/L质量浓度下，integracide A对白色念珠菌(Candidalbicans)、光滑球拟酵母菌(Torulopsisglabrata)、白色隐球菌(Cryptococcusalbidus)和黑曲霉(Aspergillusniger)等病原真菌无明显的抑菌活性，对革兰氏阴性细菌亦没有明显抑菌活性，仅对革兰氏阳性细菌如金黄色葡萄球菌(S.aureus)和链球菌(Streptococcus)有抑菌活性。本研究结果表明，integracide A对供试的8种农业病原真菌有一定的抑菌活性，其中对茄子黄萎病菌、玉米弯孢病菌、烟草赤星病菌和苹果炭疽病菌较好，其菌丝生长的EC50分别为34.90、37.77、51.64和39.08 mg/L。细菌活性测定结果与文献报道的基本一致，但化合物integracide A除对革兰氏阳性菌有抑菌活性外，本研究发现，其对重要的农业病原细菌烟草青枯病菌(革兰氏阴性菌)亦有明显的抑菌活性，其MIC为6.25 mg/L。除草活性测定结果表明，integracide A在100 mg/L质量浓度下对小麦、稗草和油菜无明显的种子萌发和根生长抑制作用，但对重要的田间杂草反枝苋有强烈的种子萌发和根生长抑制作用，其对种子萌发的EC50为13.20 mg/L，对根生长的EC50仅为3.46 mg/L。

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Received 2015-03-11Returned2015-04-24

Foundation itemNational Natural Science Foundation of China(No.31371973,No.31301700);National Natural Science Foudation of Shaanxi Province(No.2013JQ3003);Fundamental Research Funds for the Central Universities(QN2013009).

First authorLI Wanwan, female,master student.Research area:chemistry of natural product.E-mail:liwanwan@nwsuaf.edu.cn

(责任编辑：史亚歌Responsible editor:SHI Yage)

Antimicrobial and Herbicidal Activities of Integracide A,a Metabolite Produced byFusariumgraminearum

LI Wanwan, WEI Shaopeng and JI Zhiqin

(College of Plant Protection, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi712100, China)

AbstractTo understand the structure, antimicrobial and herbicidal activities of metabolite from Fusarium graminearum.The metabolite was obtained by ethyl acetate extract, gel column chromatography and reverse phase high performance liquid chromatography(RP-HPLC), and was identified based on spectral data of NMR and ESI-MS/MS.Antimicrobial activities of the compound were evaluated by inhibition of mycelial growth and micro dilution methods, respectively.Herbicidal activities were tested by plating method.The metabolite was identified as integracide A, a member of tetracyclic triterpenoid family.Integracide A showed strong antibacterial activity against Pseudomonas solanacearum, and the MIC value was 6.25 mg/L.It also exerted herbicidal activity against Amaranthus retroflexus, and the EC50were 13.20 mg/L and 3.46 mg/L against the seed germination and root growth, respectively.Integracide A was isolated from the metabolite of F.graminearum and showed a strong antibacterial and herbicidal activity.

Key wordsFusarium graminearum;Integracide A;Antimicrobial activity;Herbicidal activity

Corresponding authorJI Zhiqin, male,Ph.D,associate research fellow.Research area:chemistry of natural product.E-mail:jizhiqin@nwsuaf.edu.cn

中图分类号S481+.9

文献标志码A

文章编号1004-1389(2016)03-0465-06

通信作者：姬志勤，男，副研究员，研究方向为天然产物化学。E-mail：jizhiqin@nwsuaf.edu.cn

基金项目：国家自然科学基金(31371973，31301700)；陕西省自然科学基金(2013JQ3003)；中央高校基本科研业务费(QN2013009)。

收稿日期：2015-03-11修回日期：2015-04-24

网络出版日期：2016-03-06

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160306.1611.040.html

第一作者：李婉婉，女，硕士研究生，研究方向为天然产物化学。E-mail：liwanwan@nwsuaf.edu.cn