刘亮　巨英超　左静　曲艺　尤殿平

050011　石家庄市，河北医科大学第四医院肿瘤研究所流式细胞室(刘亮、巨英超、左静)；河北省医学情报研究所(曲艺)；河北省卫生医学科技发展研究中心(尤殿平)



·论著·

表没食子儿茶素没食子酸酯调控食管癌细胞线粒体膜电位诱导细胞凋亡作用研究

刘亮巨英超左静曲艺尤殿平

050011石家庄市，河北医科大学第四医院肿瘤研究所流式细胞室(刘亮、巨英超、左静)；河北省医学情报研究所(曲艺)；河北省卫生医学科技发展研究中心(尤殿平)

【摘要】目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate, EGCG)调控食管癌细胞Ec9706线粒体膜电位诱导细胞凋亡作用。方法不同浓度(100、200、300 mg/L) EGCG作用Ec9706细胞24 h后，Annexin V/PI双标流式细胞术方法检测细胞凋亡水平；流式细胞术检测细胞线粒体膜电位；Western Blot 方法检测细胞中Caspase-3蛋白表达水平，0.9%氯化钠溶液代替EGCG作为对照组。结果100、200、300 mg/L EGCG作用Ec9706细胞24 h后，与对照组相比Ec9706细胞凋亡率显著增高(P<0.01)，300 mg/L EGCG组细胞凋亡率显著高于100、200 mg/L EGCG组(P<0.01)。EGCG可显著降低细胞线粒体膜电位(P<0.01)，且具有剂量依赖性。western-blot结果显示，EGCG组与对照组相比Caspase-3蛋白表达水平显著增高(P<0.05)。结论EGCG具有诱导食管癌Ec9706细胞凋亡作用，其作用机制可能与调控线粒体膜电位引起内源性细胞凋亡有关。

【关键词】表没食子儿茶素没食子酸酯；食管癌；细胞凋亡；流式细胞术

绿茶具有防癌和抗癌的功效，茶多酚是其起功效的主要成分，表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate, EGCG)是绿茶提取物中主要的酚类化合物。EGCG是从中国绿茶中提取的一种成分，也是绿茶主要的活性和水溶性成分，是儿茶素中含量最高的组分，占绿茶毛重的9%～13%。研究显示，EGCG具有清除自由基、抗炎、抗氧化、抗紫外线、预防心血管疾病等功效[1-4]。研究发现，EGCG2还具有抗肿瘤活性[5-8]，引起研究者高度重视，EGCG具有低毒副作用的特点，如果能将其开发为抗肿瘤药物具有广泛的应用前景。食管癌是世界范围内常见的恶性肿瘤，发病率及病死率较高，河北省是食管癌的高发区，尤其是邯郸的磁县，食管癌发病和病死率较高，严重威胁了人们的生命健康，多数就诊患者已是中晚期，常规的手术及放化疗效果不佳，寻找高效低毒的抗食管癌药物显得十分重要。本课题探讨EGCG是否具有抗食管癌作用，利用食管癌细胞Ec9706，较系统地研究EGCG调控Ec9706细胞线粒体膜电位诱导细胞凋亡作用机制，为临床上寻找高效低毒的抗食管癌药物提供实验基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂及仪器:EGCG购自美国Sigma公司，AnnexinV-FITC/PI双染检测凋亡试剂盒购自美国Beckman Coulter公司，若丹明123(Rhodanmine 123, Rho 123)试剂购自solarbio公司，兔抗人Caspase-3抗体购自北京中杉金桥公司，胎牛血清购自杭州四季青公司。Epics-XL型流式细胞仪，美国Beckman Coulter公司。

1.1.2细胞株:人食管癌Ec9706细胞株由中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室惠赠，本实验室传代培养。接种细胞于含10%胎牛血清的PRMI1640培养基中(补充青霉素、链霉素各100 U/L)，培养器皿置于37℃含5%CO2的细胞培养箱中。

1.2方法

1.2.1实验分组及药物干预实验:取对数生长期的Ec9706细胞1×106接种至细胞培养瓶中，待细胞贴壁后，加入不同浓度的EGCG，使终浓度分别达到0、100、200、300 mg/L，对照组使用0.9%氯化钠溶液代替EGCG(0 mg/L EGCG)，作用24 h后，收集细胞，PBS液洗涤2次，300目尼龙网过滤制备成合格的单细胞悬液。每组实验重复3次。

1.2.2流式细胞术方法检测细胞凋亡:取上述制备的单细胞悬液1 ml(含1×106细胞)。冷PBS洗涤细胞1次，100 μl冷1×binding buffer 悬浮细胞，加入10 μl Annexin V-FITC，冰上避光放置15 min，加入380 μl 1×binding buffer，加入10 μl PI染液冰上避光放置15 min，冷PBS洗涤细胞1次，1 ml PBS悬浮细胞后，上流式细胞仪检测。应用Expo 32 ADC软件进行免疫荧光数据分析，计算早期细胞凋亡率及晚期细胞凋亡率。

1.2.3流式细胞术方法检测细胞线粒体膜电位:取上述制备的单细胞悬液1 ml(含1×106细胞)，冷PBS洗涤细胞1次，100 μl PBS液悬浮细胞，加入Rho 123染料，使最终浓度达到10 μg/ml，在37℃下避光平衡30 min，PBS洗涤细胞1次后，使用流式细胞仪检测。应用Expo 32 ADC软件进行免疫荧光数据分析，以平均荧光强度表示细胞线粒体膜电位水平。

1.2.4western-blot方法检测细胞中Caspase-3蛋白的表达水平:取上述制备单细胞悬液，冷PBS洗涤细胞1次，离心去上清，使用RIPA试剂常规方法提取细胞蛋白。取30 μg蛋白与1×上样缓冲液按1∶4的比例加样，于8%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至PVDF膜上。用含5%脱脂奶粉的TTBS液封闭，4℃过夜，TTBS液洗膜后加Caspase-3一抗(1∶200) 进行杂交，再度洗膜后加辣根过氧化物酶耦联的二抗(1∶2 000)进行杂交，最后洗膜后加入DAB液进行条带显色，其中β-actin为内参照。对条带进行扫描，并用Gel-Pro Analyzer 3.1软件分析条带的OD，计算Caspase-3条带OD/β-actin条带OD，作为Caspase-3的相对含量。实验重复3次。

2结果

2.1EGCG作用Ec9706细胞后细胞凋亡水平流式细胞术检测结果显示，不同浓度(100、200、300 mg/L)EGCG作用Ec9706细胞24h后，细胞凋亡率分别为(7.01±0.54)%、(15.12±0.98)%、(21.07±1.27)%，与对照组(0.56±0.08)%相比细胞凋亡率显著增高(P<0.01)，且具有剂量依赖性。见图1、2。

图1　不同浓度EGCG作用Ec9706细胞后细胞凋亡

图2　4组细胞凋亡率比较

2.2EGCG作用Ec9706细胞后细胞线粒体膜电位水平100、200、300 mg/L EGCG组Ec9706细胞线粒体膜电位水平分别为(347±16)、(286±22)、(164±17) 与对照组 (406±12) 相比显著降低(P<0.01)，且随着EGCG浓度增加，细胞内线粒体膜电位水平也呈现逐渐降低趋势，且组间比较差异有统计学意义 (P<0.01)。见图3、4。

图3　不同浓度EGCG作用Ec9706细胞后细胞线粒体膜电位水平

图4EGCG组与对照组相比，细胞线粒体膜电位水平显著降低，且具有剂量依赖性

2.3EGCG作用Ec9706细胞后细胞Caspase-3蛋白表达水平100、200、300 mg/L EGCG组Ec9706细胞Caspase-3蛋白表达量分别为(0.40±0.03)、(0.53±0.06)、(0.68±0.05),与对照组(0.28±0.05)相比显著增高(P<0.01)，且随着EGCG浓度增加，细胞内Caspase-3蛋白表达量也呈现逐渐增高趋势，且组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。见图5、6。

2.4EGCG作用Ec9706细胞后细胞凋亡水平与线粒体膜电位水平相关性分析EGCG作用Ec9706细胞后细胞凋亡水平与线粒体膜电位水平呈显著负相关性(pearson相关系数=-0.953，P=0.000)。

3讨论

绿茶具有防癌作用，本课题主要探讨绿茶中主要提取物EGCG抗食管癌作用及其相关机制，为临床上寻找高效、低毒的抗食管癌药物及为研究EGCG抗癌作用提供实验基础。EGCG是茶多酚中最有效的活性成分，属于儿茶素，EGCG是从中国绿茶中提取的一种成分，是绿茶主要的活性和水溶性成分，是儿茶素中含量最高的组分，占绿茶毛重的9%～13%。EGCG具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗动脉硬化、抗血栓形成、抗血管增生、抗炎及抗肿瘤作用，尤其在抗肿瘤作用方面，目前得到了广泛的研究。大量的研究显示了EGCG对多种肿瘤细胞具有生长抑制作用[9-12]或对化疗药物的增敏作用[13,14]。研究显示，EGCG抗肿瘤作用机制多围绕诱导细胞凋亡、引起细胞周期阻滞及诱导细胞自噬等方面[15-17]，而且研究显示，EGCG对肿瘤干细胞也具有生长抑制作用[18]。EGCG来源于绿茶，是绿茶的提取物，具有低毒副作用的特点，如果能将其开发为光谱的抗肿瘤药物，将会具有广泛的应用前景。

图5　不同浓度EGCG作用Ec9706细胞后细胞中Caspase-3蛋白表达

图6　4组Caspase-3蛋白表达量比较

食管癌是世界范围内常见的恶性肿瘤，发病及病死率较高，我国食管癌高发，尤其是河北的磁县及河南的林州食管癌发病及病死率较高，威胁了人们的生活健康。目前食管癌的常规治疗包括手术、化疗及放疗，对于晚期或不能手术者，往往选择放疗及化疗，目前由于化疗药物的高毒副作用及耐药的产生严重影响了其治疗效果，最终导致化疗失败。寻找高效低毒的抗食管癌药物显得格外重要。绿茶是人们常用饮品，具有安全无毒的特点，如能将其提取物EGCG用于抗癌药物具有广泛的应用前景。目前研究显示，EGCG对多种肿瘤细胞具有生长抑制作用[19,20]，但在食管癌中的研究较少，且缺乏系统的机制研究，本课题通过观察EGCG是否对Ec9706细胞线粒体膜电位有影响，研究其是否能够通过线粒体膜电位的内源性凋亡通路引起食管癌细胞凋亡，为临床上食管癌治疗提高高效、低毒的抗食管癌药物提供实验基础。

细胞增殖及细胞凋亡间的平衡维持着正常细胞生长，细胞凋亡的异常往往会引起细胞的恶性转化，因此，诱导细胞凋亡是目前新药物研发评价药物疗效的主要指标。细胞凋亡途径包括，外部途径，通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶caspase；另一条通路是内部途径，通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase。内源性凋亡途径是目前研究药物诱导肿瘤细胞凋亡常用的途径[21]。在本实验中首先观察到了EGCG对食管癌Ec9706细胞具有诱导细胞凋亡和直接杀伤作用，这些结果通过流式细胞术的AnnexinV-PI双染方法进行，可以同时检测到了细胞凋亡及坏死的细胞比例，且EGCG对食管癌Ec9706细胞诱导凋亡作用具有剂量依赖性，随着EGCG浓度的增加，EGCG诱导Ec9706细胞凋亡率也随之增加，这样奠定了EGCG具有抗食管癌作用基础，接下来进一步研究EGCG对食管癌Ec9706细胞诱导凋亡的作用机制。通过研究细胞内线粒体膜电位的实验结果，提示，EGCG可以降低细胞内线粒体膜电位，线粒体膜电位的减低可以使诱导细胞凋亡的因子(如细胞色素C等)释放从而激活Caspase-3等蛋白，引起细胞凋亡，且EGCG降低细胞内线粒体膜电位水平具有EGCG浓度依赖性，随着EGCG浓度的增加，EGCG降低Ec9706细胞内线粒体膜电位水平也随之增加。同时实验中也发现，EGCG组Ec9706细胞中Caspase-3蛋白表达水平显著增高，且具有EGCG的浓度依赖性。这些结果与线粒体凋亡的内源性凋亡途径因子变化趋势一致。

综合上述的研究结果，提示，EGCG可以诱导Ec9706细胞凋亡及直接杀伤细胞，诱导细胞凋亡的机制与降低线粒体膜电位及升高Caspase-3蛋白表达水平有关。EGCG具有低毒、价廉的特点，如果能将其开发为抗食管癌药物，将具有广泛的应用前景。

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Epigallocatechin-3-gallate induced Ec9706 cell apoptosis by regulating the mitochondrial transmembrane potential

LIULiang,JUYingchao,ZUOJing,etal.

DepartmentofFCM,ResearchinstituteofOncology,TheFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of and action mechanism of epigallocatechin-3-gallate (EGCG) in inducing cell apoptosis of esophageal cancer (Ec9706 cell) through regulating mitochondrial transmembrane potential.MethodsThe Ec9706 cells were treated by different doses of EGCG (100,200,300mg/L) for 24h,then the cell apoptosis rates were detected by AnnexinV/PI staining. The mitochondrial transmembrane potential was measured by flow cytometry.Moreover the expression levels of Caspase-3 protein were detected by Western Blot. Normal saline instead of EGCG was used as control group.ResultsAfter Ec9706 cells were treated by different doses of EGCG (100,200,300mg/L) for 24h,the cell apoptosis rates in EGCG groups were significantly increased,as compared with those in control group (P<0.05), moreover, which in 300mg/L EGCG group were significantly higher than those in 100mg/L and 200mg/L EGCG group (P<0.01). EGCG could obviously decrease mitochondrial transmembrane potential (P<0.01),with a dose-dependent manner. The results by Western Blot showed that the expression levels of Caspase-3 protein in EGCG groups were significantly increased,as compared with those in control group (P<0.05).ConclusionEGCG has the effects of inducing Ec9706 cell apoptosis,and its action mechanism may be correlated to regulating mitochondrial transmembrane potential to induce endogenous cell apoptosis.

【Key words】epigallocatechin-3-gallate; esophageal cancer; cell apoptosis; flow cytometry

(收稿日期：2015-10-20)

【中图分类号】R 735.1

【文献标识码】A

【文章编号】1002-7386(2016)10-1457-04

通讯作者：尤殿平，050000河北省卫生医学科技发展研究中心；

doi:10.3969/j.iss n.1002-7386.2016.10.004

项目来源：河北省医学科学研究重点课题(编号：20150345;20160167)；河北省普通高等学校强势特色学科肿瘤学建设经费[冀教高(2005)52号]

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