徐 明， 杨 洋， 车拴龙， 朴英实， 林贞花, ， 陈丽艳△

(延边大学 1医学院病理学教研室， 2肿瘤研究中心，吉林 延吉 133002)

NQO1过表达在卵巢黏液性囊腺癌预后评估中的意义*

徐 明1， 杨 洋1， 车拴龙1， 朴英实2， 林贞花1, 2， 陈丽艳2△

(延边大学1医学院病理学教研室，2肿瘤研究中心，吉林 延吉 133002)

目的： 探讨NAD(P)H醌氧化还原酶1[NAD(P)H-quinone oxidoreductase 1，NQO1]过表达在卵巢黏液性囊腺癌临床预后评估中的意义。方法: 应用免疫组化EnVision法检测NQO1蛋白在162例卵巢黏液性囊腺癌组织、35例卵巢黏液性囊腺瘤组织和29例正常卵巢上皮组织中的表达，并分析其过表达与卵巢黏液性囊腺癌临床病理学特点之间的关系，通过Kaplan-Meier方法进行生存分析。结果: NQO1蛋白在卵巢黏液性囊腺癌组织中的阳性率及强阳性率分别为85.8%和64.2%，显著高于卵巢黏液性囊腺瘤和正常卵巢上皮组织(P<0.01)。卡方检验结果显示，NQO1蛋白高表达与卵巢黏液性囊腺癌组织学分级和FIGO分期密切相关(P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析显示，NQO1蛋白高表达的卵巢黏液性囊腺癌患者总生存期和无病生存期均明显低于NQO1蛋白低表达患者。结论: NQO1蛋白在卵巢黏液性囊腺癌组织中呈高表达，可能成为卵巢黏液性囊腺癌预后评估的有效生物学指标。

卵巢黏液性囊腺癌； NAD(P)H醌氧化还原酶1； 免疫组化； 无病生存期； 预后

卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，种类较多。其中，卵巢黏液性囊腺癌是常见类型，发病率仅次于卵巢浆液性囊腺癌，但其5年生存期仅为30%左右[1]，严重威胁妇女的生命健康[2]。由于卵巢黏液性囊腺癌生长部位隐蔽，肉眼观察不到，早期临床症状与炎症相似，体征不明显，确诊时多已发展为晚期，故其生存期短且预后差。因此，探讨卵巢黏液性囊腺癌的发病机制，寻找其早期诊断和预后评估的有效指标极为重要。

NAD(P)H醌氧化还原酶1[NAD(P)H-quinone oxidoreductase 1，NQO1]以NAD(P)H为受体，催化醌类及其衍生物，避免其损伤细胞并保护机体免受致癌物影响[3]。有研究表明，NQO1蛋白在结直肠癌[3]、肾透明细胞癌[4]、肺癌组织[5]、子宫颈癌[6]、浸润性卵巢癌[7]、胰腺癌[8]等多种恶性肿瘤异常表达，且其高表达与肿瘤发生发展密切相关。但目前尚未见NQO1蛋白与卵巢黏液性囊腺癌的相关报道。因此，本研究旨在应用免疫组化EnVision法检测NQO1蛋白在卵巢黏液性囊腺癌组织中的表达情况，探讨NQO1蛋白表达检测在卵巢黏液性囊腺癌中的临床病理学意义及其与患者生存期的关系，为卵巢黏液性囊腺癌预后评估提供新的分子指标。

材 料 和 方 法

1 临床资料

临床资料齐全的卵巢组织标本选自2000年1月～2010年12月延边大学医学院肿瘤组织库和延边妇幼保健院病理科。其中包括162例卵巢黏液性囊腺癌、35例卵巢黏液性囊腺瘤组织和29例正常卵巢上皮组织。162例卵巢黏液性囊腺癌患者中，年龄≥48岁的有98例，<48岁的有64例。根据国际妇科学会(FIGO)2014年修订的卵巢癌分期标准对卵巢癌进行临床分期，其中FIGO I-II期(早期)有93例，FIGO III-IV期(晚期)有69例。所有患者在术前均未接受放疗或化疗，患者随访均超过5年，平均生存时间为48.4个月，五年生存率为32.7%。

2 方法

免疫组化EnVision法检测试剂盒为Dako产品；NQO1鼠抗人单克隆抗体购自Santa Cruz。染色步骤为常规脱蜡、抗原修复，加入 I 抗(1∶200稀释)4 ℃孵育过夜；次日滴加 II 抗，DAB显色，Mayer苏木素复染，中性树胶封片。为了证明NQO1蛋白抗体免疫组化检测的特异性，实验中应用了鼠IgG代替 I 抗作为对照，结果为阴性。同时，选择NQO1蛋白阳性染色的切片，以PBS代替 I 抗染色的结果为阴性，以此作为结果可信的实验依据。

3 结果判断标准

免疫组化染色结果以双评分半定量法进行判定。将有棕黄色颗粒在细胞浆内出现视为阳性。按染色强度，无着色记为0分，淡黄色记为1分，棕黄色记为2分，棕褐色记为3分；每张切片在高倍镜(×400)下随机选取10个视野，每个视野计数100个细胞进行分级，阳性细胞数占0%～5%的记为0分，阳性细胞数占5%～25%的记为1分，阳性细胞数占26%～50%的记为2分，阳性细胞数占50%～75%的记为3分，阳性细胞数>75%的记为4分。最后将两项计分结果相乘，0分记为“-”，1～4分记为“+”，5～8分记为“++”，9～12分记为“+++”。阳性率是“+”、“++”和“+++”的病例数占总病例数的百分比；强阳性率是“++”和“+++”的病例数占总病例数的百分比。

4 统计学处理

应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，各组间NQO1蛋白表达的统计差异分析采用2检验，应用Kaplan-Meier进行生存分析，以P<0.05为差异有统计学显著性。

结 果

1 NQO1蛋白在卵巢黏液性囊腺癌组织中过表达

NQO1蛋白在卵巢黏液性囊腺癌组织中主要呈现细胞浆表达，少量细胞核表达。NQO1蛋白在29例正常卵巢上皮组织中仅有3例呈现强阳性，阳性率是37.9%，强阳性率是10.3%；在162例卵巢黏液性囊腺癌组织中的阳性率和强阳性率分别是85.8%和64.2%；在卵巢黏液性囊腺瘤组织中的阳性率和强阳性率分别为60.0%和42.9%，差异有统计学显著性(P<0.01)，见图1、表1。

2 NQO1蛋白过表达与卵巢黏液性囊腺癌临床病理参数的关系

NQO1蛋白高表达与卵巢黏液性囊腺癌的组织学分级和FIGO分级密切相关(P<0.05)，但是与患者的年龄和绝经状态不相关。NQO1蛋白在组织学分级2级和3级中的表达明显高于1级；而且在FIGO分级III～IV期(晚期)中NQO1蛋白高表达占95.7%，明显高于I～II期(早期)，见表2。

Figure 1.IHC staining of NQO1 protein in ovarian samples (×400). A: weakly positive expression of NQO1 protein in ovarian mucinous cystadenoma; B: positive expression of NQO1 protein in ovarian mucinous cystadenocarcinoma; C: strongly positive expression of NQO1 protein in ovarian mucinous cystadenocarcinoma, which was mainly located in cytoplasm and gathered around the nucleus.

图1 NQO1蛋白在卵巢组织中的表达

表1 NQO1蛋白在各组卵巢病变组织中的表达

*P<0.05,**P<0.01vsnormal ovarian epithelium;#P<0.01vsovarian mucinous cystadenoma.

表2 NQO1蛋白过表达与卵巢黏液性囊腺癌临床病理参数的关系

3 NQO1蛋白过表达与卵巢黏液性囊腺癌患者生存期之间的关系

应用Kaplan-Meier方法分析162例卵巢黏液性囊腺癌的生存期与NQO1蛋白的关系，绘制生存曲线显示，NQO1蛋白高表达的卵巢黏液性囊腺癌患者的总生存期和无瘤生存期均明显低于NQO1蛋白低表达者(P<0.01)，见图2，提示NQO1蛋白对卵巢黏液性囊腺癌患者生存期有显著影响。

讨 论

卵巢黏液性囊腺癌严重影响女性患者的生活质量，由于缺乏对卵巢黏液性囊腺癌的有效早期诊断以及分子治疗靶点的识别，晚期卵巢黏液性囊腺癌患者的5年死亡率一直居高不下。因此，发现有效的卵巢黏液性囊腺癌早期诊断以及预后评估分子标志物，对提高患者生存率具有重要意义。

Figure 2. Kaplan-Meier survival curves illustrated the significance of NQO1 expression in ovarian mucinous cystadenocarcinoma. A: the correlation between NQO1 expression and overall survival rate; B: the correlation between NQO1 expression and disease-free survival rate.

图2 NQO1表达与卵巢黏液性囊腺癌患者预后的Kaplan-Meier生存曲线

NQO1蛋白是一类普遍存在于真核细胞内的黄素蛋白酶，可为细胞提供多层次的氧化应激保护，包括高活性的醌类解毒、维护脂溶性抗氧化剂减少、稳定抑癌基因p53等[9-10]。NQO1基因位于人染色体16 q21～22区段，研究发现，其C609T位点易发生基因突变，可使机体重要的细胞防御机制无法抵抗光谱毒性物质及醌类衍生物对机体的致癌作用和其它毒性作用[11]。代恩勇等[12]应用聚合酶链反应-限制性片段多态性(PCR-RFLP)基因型分析技术对NQO1 cDNA 609位点多态性进行测定，结果证实NQO1基因多态性与大肠癌的发生有一定相关性。Fagerholm等[13]研究也提示NQO1基因表型可视为乳腺癌预后评估的标志。这可能是由于NQO1多态性导致黄素蛋白酶活性降低甚至失活，从而减弱或者丧失NQO1对细胞的保护作用，增加了个体患肿瘤的可能性。

近年来的研究发现，NQO1蛋白在多种肿瘤组织中呈现高表达。有文献报道，通过免疫组化的方法和逆转录聚合酶链反应检测出NQO1在肾透明细胞癌中呈高表达，且其高表达与肾透明细胞癌发生发展及预后密切相关[4]。本组实验结果发现：与正常癌旁组织和卵巢黏液性囊腺瘤相比，卵巢黏液性囊腺癌中NQO1蛋白的阳性及强阳性表达明显升高，且NQO1蛋白的表达与卵巢黏液性囊腺癌的组织学分级和FIGO分级显著相关；结果还显示随着卵巢黏液性囊腺瘤恶性程度的增高，NQO1蛋白的表达也异常增高，以上均提示NQO1蛋白的表达可能在卵巢黏液性囊腺癌的发生、发展中发挥重要的作用。作为氧化应激反应的关键调节因子，NQO1蛋白在恶性肿瘤中高表达的分子机制有待于进一步研究。

本课题组的前期研究表明，NQO1蛋白在结直肠癌中呈高表达，是结直肠癌的独立风险因子[3]；此外，通过Kaplan-Meier生存分析的结果表明，NQO1对头颈部鳞状细胞癌患者生存期有显著影响[14]。Awadallah等[15]在胰腺导管腺癌中发现标记NQO1蛋白可以成为有用的临床治疗预后评估的辅助指标。在本研究中，通过生存分析发现，卵巢黏液性囊腺癌患者NQO1蛋白高表达组的总生存期和无病生存期与低表达组相比显著降低，提示NQO1参与卵巢黏液性囊腺癌的进展，并可作为有效的预后评定指标之一。

综上所述，NQO1蛋白在卵巢黏液性囊腺癌中表达明显上调，为临床上卵巢黏液性囊腺癌的预后判定提供了可能的理论依据。NQO1蛋白有期望成为临床上卵巢黏液性囊腺癌的预后指标和潜在的分子靶向治疗目标。

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(责任编辑： 林白霜， 罗 森)

Prognostic significance of NAD(P)H-quinone oxidoreductase 1 overexpression in ovarian mucinous cystadenocarcinoma

XU Ming1, YANG Yang1, CHE Shuan-long1, PIAO Ying-shi2, LIN Zhen-hua1,2, CHEN Li-yan2

(1DepartmentofPathology，MedicalCollege,2CancerResearchCenter,YanbianUniversity,Yanji133002,China.E-mail:lychen@ybu.edu.cn)

AIM: To investigate the significance of NAD(P)H-quinone oxidoreductase 1 (NQO1) protein overexpression for prognostic evaluation of ovarian mucinous cystadenocarcinoma.METHODS: NQO1 protein was detected in 162 cases of ovarian mucinous cystadenocarcinoma, 35 cases of ovarian mucinous cystadenoma and 29 samples of normal ovarian epithelial tissues by the method of EnVision immunohistochemical staining. The correlation between high expression of NQO1 protein and clinicopathological features of ovarian mucinous cystadenocarcinoma was also evaluated. Overall survival and disease-free survival rates of ovarian mucinous cystadenocarcinoma patients were calculated by Kaplan-Meier method. RESULTS: The positive rate and strongly positive rate of NQO1 protein were 85.8% and 64.2% in ovarian mucinous cystadenocarcinoma, respectively, which are significantly higher than those in ovarian mucinous cystadenoma, and normal ovarian epithelial tissues (P<0.01). NQO1 expression was significantly correlated with the histological grade (P<0.05) and clinical stage (P<0.01) of ovarian mucinous cystadenocarcinoma. Kaplan-Meier survival analysis showed that the overall survival rate and disease-free survival rate were significantly higher in ovarian mucinous cystadenocarcinoma patients with high NQO1 expression than those with low NQO1 expression (P<0.01).CONCLUSION: NQO1 expression is closely correlated with the progression and prognosis of the patients with ovarian mucinous cystadenocarcinoma. High expression of NQO1 protein may be used as an important indicator for the patients with poor prognosis of ovarian mucinous cystadenocarcinoma.

Ovarian mucinous cystadenocarcinoma; NAD(P)H-quinone oxidoreductase 1; Immunohistochemistry; Disease-free survival; Prognosis

1000- 4718(2016)08- 1461- 05

2016- 03- 03

2016- 06- 15

国家自然科学基金资助项目(No. 81460399)

R730.23； R737.31

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.021

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