胡　波，范红伟，鲍军强，王燕午，马广骏，李　锋

(1. 解放军第260医院，河北 石家庄 050041；2. 河北省石家庄市第四医院，河北 石家庄 050011；3. 第四军医大学附属西京医院，陕西 西安 710032)



丹参单体IH764-3对糖尿病肾病大鼠水通道蛋白表达的影响

胡波1，范红伟2，鲍军强1，王燕午1，马广骏1，李锋3

(1. 解放军第260医院，河北 石家庄 050041；2. 河北省石家庄市第四医院，河北 石家庄 050011；3. 第四军医大学附属西京医院，陕西 西安 710032)

[摘要]目的观察丹参单体IH764-3对糖尿病肾病大鼠肾脏水通道蛋白(AQP)2、AQP4及肺脏AQP1表达的影响，探讨丹参单体IH764-3对糖尿病肾病大鼠水液代谢异常的调节机制。方法从60只SD大鼠中随机选择10只作为正常组，剩余50只采用高糖高脂饲料刺激加小剂量STZ诱导糖尿病肾病大鼠模型，将成模大鼠30只随机分为模型组、对照组、研究组各10只。对照组给予卡托普利灌胃，研究组给予卡托普利灌胃同时腹腔注射丹参单体IH764-3，正常组和模型组灌胃等量蒸馏水。灌胃16周末处死大鼠，留取肾、肺组织行病理观察，采用免疫组化法、Western blot印记法、RT-PCR法检测肾组织中AQP2、AQP4及肺组织中AQP1蛋白及mRNA表达情况。结果肾组织中AQP2、AQP4蛋白及mRNA表达量模型组均明显高于正常组(P均<0.05)，对照组、研究组均明显低于模型组(P均<0.05)，研究组均低于对照组(P均<0.05)。肺组织中AQP1蛋白及mRNA表达量模型组均明显低于正常组(P均<0.05)，研究组与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)，对照组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论AQP2、AQP4在肾脏组织表达的增多及AQP1在肺脏组织表达的减少可能是导致糖尿病水液代谢异常的重要机制之一。丹参单体IH764-3对水通道蛋白的表达有调节作用，这可能是其调节水液代谢作用的机制，也是其防治糖尿病肾病的基础。

[关键词]糖尿病肾病；水通道蛋白；丹参单体IH764-3

糖尿病肾病(DN)是糖尿病最常见的微血管并发症，是糖尿病患者的主要死亡原因之一。DN患者存在水液代谢紊乱，其中Ⅳ期DN患者中80%会出现水肿。祖国医学认为肾脏和肺脏是体内水液代谢的重要脏器，水液代谢紊乱是糖尿病肺、肾损伤的独立危险因素。前期研究表明：水通道蛋白家族(AQPs)在糖尿病及其微血管并发症发生发展中起重要作用[1]。本研究进一步观察了丹参单体IH764-3对水通道蛋白(AQP)2、AQP4、AQP1表达的影响，旨在探讨AQP2、AQP4、AQP1的表达与DN水液代谢异常的关系以及丹参的药理效应，为DN的预防和治疗提供依据。

1实验资料

1.1实验动物4周龄雄性SPF级SD大鼠60只，体质量(165±12.5)g，河北医科大学实验动物中心提供，合格证号：1312053。SPF级环境饲养，环境温度20～25 ℃，12 h∶12 h昼夜规律，每笼5只。

1.2药物卡托普利片(25 mg/片)，常州制药有限公司生产，批号：32023731；丹参单体IH764-3，购自天津血液研究所；链脲佐菌素(STZ)，美国Sigma公司。

1.3主要试剂与仪器AQP2兔多克隆抗体(sc-28629)、AQP4兔多克隆抗体(sc-20812)、AQP1兔多克隆抗体(sc-29612)、SABC试剂盒(sc-2081)、Actin (sc-1616)购自美国SANTA CRUZ公司。TRIZOL Reagent购自Invitrogen公司，反转录试剂盒购自美国Fermentas公司，PCR试剂盒(M7122)购自美国Promega公司, 辣根酶标记山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。BCA法蛋白定量试剂盒购自北京百泰生物技术有限公司。GeneAMP PCR system 2400(Applied Biosystems)；UV-2501PC型分光光度计(日本岛津仪器厂生产)；Miaspro图像分析系统。

1.4实验方法

1.4.1动物分组、造模及给药随机从60只大鼠中选择10只作为正常组，给予普通饲料喂养；其余50只大鼠参照文献[2]方法给予高糖高脂饲料(即普通饲料中加入10%猪油、10%葡萄糖、1%胆固醇、2%蛋黄粉、0.2%胆酸钠)喂养，在高糖高脂饲料喂养4周后尾静脉注射STZ 30 mg/kg，以注射后1个月血糖值持续高于7.8 mmol/L、尿糖阳性为造模成功。将造模成功30只大鼠随机分为模型组、对照组和研究组，每组10只。对照组给予卡托普利25 mg/(kg·d)灌胃，研究组在灌胃卡托普利的同时腹腔注射丹参单体IH764-3 40 mg/(kg·d)，正常组和模型组灌胃等体积的蒸馏水，均每天1次。实验期间室温保持在20～24 ℃，相对湿度40%。所有动物自由饮水，正常组给予普通饲料喂养，其余组给予高糖高脂饮食。

1.4.2肺、肾组织留取灌胃第16周末，用25%乌拉坦麻醉大鼠，打开腹腔，充分暴露两侧肾脏，取1/2的肾脏迅速放入4%多聚甲醛中固定，用于石蜡切片。开胸取肺组织，迅速放入装有4%甲醛的瓶中固定。右肺中、下叶用于病理学观察，左肺进行免疫组化染色。余下肺、肾组织用消毒铝箔包好迅速放入液氮中，保存于-80 ℃冰箱中，备用于PCR样本的提取。

1.4.3肾组织中AQP2、AQP4免疫组化检测按试剂盒操作步骤进行加样，以SABC法进行检测，一抗为Rabbit anti-AQP2，4。细胞质中呈现棕黄色颗粒为阳性反应，采用Miaspro图像分析系统进行分析。每组随机取6只动物，每只动物AQP2、AQP4染色各取3张切片，观察3个视野，视野面积480 000 mm2，测定阳性面积比[Aa(%)]，Aa(%) =阳性面积/视野面积。

1.4.4肺组织中AQP1免疫组化检测按试剂盒操作步骤进行加样，以SABC法进行检测，一抗为Rabbit anti-AQP1。肺泡间质中微血管呈现棕黄色为阳性。每组随机取6只动物，每只动物AQP1染色各取3张切片，各观察3个视野，视野面积为480 000 mm2，免疫组化结果以单个视野下阳性微血管数表示。

1.4.5肾组织中AQP2、AQP4及肺组织中AQP1 mRNA表达检测采用RT-PCR法检测。引物采用Primer 5.0设计。AQP2、AQP4、AQP1和β-actin引物均由上海生工生物技术有限公司合成。用TRIZOL进行组织总RNA的提取，对总RNA进行定量；逆转录按试剂盒说明进行；电泳结束后用Image-Pro Plus对电泳条带进行光密度分析，以目的条带光密度参数与内参基因条带的光密度参数比值作为该标本mRNA的表达水平参数。见表1。

表1　AQP2、AQP4、AQP1及β-actin

1.4.6肾组织中AQP2、AQP4及肺组织中AQP1蛋白表达检测采用Western blot法检测。用裂解液提取组织总蛋白，按BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，10%SDSPAGE电泳，转移蛋白至硝酸纤维膜上。5%正常羊血清封闭，AQP2、AQP4、AQP1多克隆抗体(1∶400稀释)4 ℃孵育过夜，二抗(1∶2 500稀释)孵2 h。化学发光法发光成像，以actin为内参照，对目的蛋白表达水平进行半定量分析。

1.5统计学方法数据用SPSS 16.0统计软件进行分析，采用One-way ANOVA法进行方差分析。两两比较时根据其方差是否齐性选择LSD或Dunnett C方法。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组大鼠一般状况正常组大鼠体质量稳定增长，皮毛光泽，一般情况好；模型组大鼠出现多饮、多食、多尿，早期体质量有不同程度增加，8周后一般情况变差，体质量下降，毛发失去光泽，后期出现腹胀。对照组和研究组大鼠的一般情况较好，体质量比较稳定，“三多一少”症状较模型组明显减轻，没有观察到腹胀。

2.2各组大鼠肾组织病理表现正常组肾小球结构清晰，肾小管上皮细胞排列整齐，基底膜完整，间质中未见炎症细胞浸润、纤维组织增生，见图1；模型组肾小球明显肥大，系膜区增宽，系膜细胞增生、基质增多，血管壁增厚，球内可见大量红细胞淤积，肾小管上皮细胞弥漫性空泡状变性、肿胀脱落，部分肾小管内有蛋白管型淤积，见图2；对照组上皮细胞空泡状变性呈片状，肾小球内可见红细胞淤积，肾小管偶见上皮细胞脱落，小管内可见蛋白管型，见图3；研究组上皮细胞空泡状变性呈局灶状，仅存在于肾被膜下，肾小球内少见红细胞淤积，肾小管未见上皮细胞脱落，小管内少见蛋白管型，见图4。

图1　正常组肾组织HE染色表现(×100)

图2　模型组肾组织HE染色表现(×100)

2.3各组大鼠肺组织病理学表现正常组肺组织肺泡无萎陷，肺泡壁无增厚，肺泡间隔无增宽，肺泡和肺间质无炎细胞浸润，见图5；模型组肺泡腔缩小，肺泡数量增多，肺泡隔明显增宽，成纤维细胞数量增加，毛细血管基底膜增厚，血管扩张淤血，腔内充满红细胞，有较多中性粒细胞浸润，见图6；研究组和对照组肺组织上述改变减轻，见图7及图8。

图3　对照组肾组织HE染色表现(×100)

图4　研究组肾组织HE染色表现(×100)

图5　正常组肺组织HE染色表现(×100)

图6　模型组肺组织HE染色表现(×100)

图7　研究组肺组织HE染色表现(×100)

图8　对照组肺组织HE染色表现(×100)

2.4各组肾组织中AQP2、AQP4免疫组化染色表现正常组AQP2、AQP4蛋白在肾集合管表达，而在肾小球和肾间质未见表达；模型组AQP2、AQP4蛋白沿集合管内壁上皮细胞分布的棕黄色颗粒比正常组颜色加深而浓厚，分布面积广泛；对照组和研究组AQP2、AQP4的棕黄色颗粒颜色比模型组明显变浅，分布面积减小。见图9～16。

图9　正常组肾组织中AQP2免疫组化染色表现

图10　模型组肾组织中AQP2免疫组化染色表现

图11　对照组肾组织中AQP2免疫组化染色表现

2.5各组肺组织中AQP1免疫组化染色表现正常组中肺泡周围和支气管周围的毛细血管内皮及肺泡上皮均有AQP1阳性染色(棕黄色)，且毛细血管内皮整个周缘较肺泡上皮阳性染色强，提示AQP1主要表达于肺毛细血管内皮细胞，见图17；模型组AQP1在毛细血管内皮细胞表达明显减少，见图18；研究组AQP1免疫组化染色表现与正常组相似，见图19；对照组AQP1免疫组化染色表现与模型组相似，见图20。

图12　研究组肾组织中AQP2免疫组化染色表现

图13　正常组肾组织中AQP4免疫组化染色表现

图14　模型组肾组织中AQP4免疫组化染色表现

图15　对照组肾组织中AQP4免疫组化染色表现

图16　研究组肾组织中AQP4免疫组化染色表现

图17　正常组肺组织中AQP1免疫组化染色表现

图18　模型组肺组织中AQP1免疫组化染色表现

图19　研究组肺组织中AQP1免疫组化染色表现

图20　对照组肺组织中AQP1免疫组化染色表现

2.6各组大鼠肾组织中AQP2、AQP4和肺组织中AQP1 mRNA表达量比较模型组肾组织中AQP2和AQP4 mRNA表达量均明显高于正常组(P均<0.05)；研究组和对照组AQP2、 AQP4 mRNA表达量均明显低于模型组(P均<0.05)，研究组均明显低于对照组(P均<0.05)。模型组肺组织中AQP1 mRNA表达量明显低于正常组(P<0.05)，研究组AQP1 mRNA表达量明显高于模型组和对照组(P均<0.05)，对照组AQP1 mRNA表达量与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2　各组大鼠肾组织中AQP2、AQP4和肺组织中

注：①与正常组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与对照组比较，P<0.05。

2.7各组大鼠肾组织中AQP2、AQP4和肺组织中AQP1蛋白表达量比较模型组肾组织中AQP2、AQP4 蛋白表达量均明显高于正常组(P均<0.05 )；对照组大鼠肾组织中AQP2、AQP4蛋白表达量与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，研究组大鼠肾组织中AQP2、AQP4蛋白表达量明显低于模型组与对照组(P均<0.05)。模型组肺组织中AQP1蛋白表达量明显低于正常组(P<0.05)，研究组AQP1蛋白表达量明显高于模型组和对照组(P均<0.05)，与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)；对照组AQP1蛋白表达量与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3　各组大鼠肾组织中AQP2、AQP4和肺组织中

注：①与正常组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与对照组比较，P<0.05。

3讨论

糖尿病属于中医“消渴”范畴，消渴日久则出现的“水肿”“胀满”“尿浊”“关格”与现代医学DN的临床症状相似。《景岳全书·肿胀》篇说：“凡水肿等证，乃肺脾肾三脏相干之病，盖水为至阴，故其本在肾-其标在肺-其制在脾。”《素问·水热穴论》曰:“肾者,胃之关也。关门不利，故聚水而从其类也，上下溢于皮肤，故为胕肿。胕肿者，聚水而生病也。”《素问·经脉别论》说：“饮入于胃，游溢精气，上输于脾，脾气散精，上归于肺，通调水道，下输膀胱，水精四布，五经并行。”在水液代谢过程中，肾气的气化、开合功能起着十分重要的作用。“肾阳为开”“肾阴为合”,肾阴肾阳不平衡,开合失调,将导致人体尿量失常；只有肾阴肾阳平衡,水液的排出才能正常适量。

目前西医研究发现，AQPs的表达异常与DN的发生、发展和转归密切相关。其中AQP1表达于肺泡周围的毛细血管内皮细胞，其主要作用是调节肺内毛细血管与肺泡间水通透性。有资料显示AQP1基因敲除小鼠肺渗透压依赖的被动性水转运被抑制90%[3]。尿液的浓缩稀释功能主要由肾脏集合管主细胞的AQP2、AQP4来完成。血管加压素(AVP)与肾组织集合管主细胞基底膜上的AVP V2受体结合后，使细胞内cAMP浓度升高，激活PKA，将AQP2蛋白磷酸化，使之从囊泡穿梭到管腔膜，从而提高集合管对水的通透性[4]，同时该信号可刺激AQP2的合成，提高AQP2 mRNA和蛋白水平的表达，从而实现AVP的抗利尿作用。既往研究表明在糖尿病大鼠中血AVP水平升高[5]，这可能与水钠潴留有关。AQP2 、AQP4缺陷或突变则会严重影响尿液的浓缩能力，从而出现肾源性尿崩症[6]。

丹参具有活血祛瘀、清心除烦、凉血消痈等功效，在《神农本草经》中被奉为上品，有“一味丹参，功同四物”之称。现代药理研究显示，丹参具有醛糖还原酶抑制剂的作用，而醛糖还原酶抑制剂可以减少山梨醇及其他糖化终末产物的形成，对治疗和预防糖尿病慢性并发症有一定作用[7]。丹参还可以扩张血管，加快血液流速，从而改善微循环，因此“血行则水行”，局部的水肿状态得以改善[8-9]。丹参的有效单体IH764-3及其脂溶性成分丹参酮、水溶性成分丹参素等有增加肾血流、利尿和抗炎作用，可降低血BUN、SCr，调节肾组织局部微循环，改善肾功能[1]。且前期的研究已证实丹参对肾组织AQP2及肺组织AQP1均有调节作用[10]。本研究结果表明丹参单体IH764-3联合卡托普利能显著改善“三多一少”症状，能显著降低DN大鼠肾组织中AQP2、AQP4蛋白及mRNA表达量，提高AQP1蛋白及mRNA在肺组织中的表达，因此推测丹参单体IH764-3对DN大鼠肾脏的保护作用可能与降低AQP2、AQP4，导致AQP2、AQP4在肾脏集合管重新分布有关，升高AQP1的表达改变微血管通透性，以减轻糖尿病病变脏器的水肿病理状态有关。但丹参单体IH764-3改善水液代谢作用机制是如何通过改变DN时肺组织AQP1的表达和肾组织AQP2及AQP4在肾脏集合管分布部位而发挥作用的，有待进一步深入探讨。

[参考文献]

[1]胡波，范红伟，姚欣，等. 丹参注射液联合卡托普利通过调节水通道蛋白2对Ⅳ期糖尿病肾病患者肾功能影响[J]. 时珍国医国药杂志,2013，24(2)：345-346

[2]郭啸华，刘志红，李恒，等. 实验性2型糖尿病大鼠模型的建立[J]. 肾脏病与透析移植杂志,2000，9(4)：351-355

[3]Sui H,Han BG, Lee J K,et al. Structural basis of water-specific transport through the AQP1 water channel[J]. Nature,2001,414(6866):872-878

[4]Nielsen S,Kwon TH,Frokiaer J,et al. Key roles of renal aquaporins in wate balance and water balance disorders[J]. Nexevs Physiol Sci,2000，15(3)：136-143

[5]杜娟，张素华. 糖尿病大鼠肾脏髓质水通道蛋白2的表达和意义[J]. 中华内分泌代谢杂志,2006，22(1)：67-71

[6]Kuwahara M,Asai T,Terada Y,et al. The C-terminal ta il of aquaporin-2 determines apieal trafieking[J]. Kidney Int，2005，68(5):1999-2009

[7]张卫平. 浅谈活血化瘀法在糖尿病肾病治疗中的运用[J]. 实用中医药杂志，2003，19(5)：268

[8]李锋，李晓苗，王汉民，等. 化瘀利水法治疗糖尿病肾病中医临床机制分析[J]. 中国中西医结合肾病杂志,2005，6(11)：673-674

[9]李锋，王汉民，行利，等. 泽黄颗粒治疗糖尿病肾病38例临床观察[J]. 中国中医药信息杂志,2005，12(10)：64-65

[10] 胡波，范红伟，鲍军强，等. 丹参对糖尿病肾损伤大鼠水液代谢异常与水通道蛋白调节机制探讨[J]. 时珍国医国药杂志,2011，22(2)：356-358

Regulatory effect of Salvia miltiorrhiza monomer IH764-3 on the expression of Aquaporin in rats with diabetic nephropathy

HU Bo1, FAN Hongwei2, BAO Junqiang1, WANG Yanwu1, MA Guangjun1, LI Feng3

(1. The 260th Hospital of PLA, Shijiazhuang 050041, Hebei, China; 2. The Fourth Hospital of Shijiazhuang, Shijiazhuang 050011, Hebei, China; 3. Xijing Hospital Affiliated to the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi, China)

Abstract:Objective It is to observe the effect of expression of Salvia miltiorrhiza monomer IH764-3 on the expression of Aquaporin 2 (AQP2), AQP4 in kidney and AQP1 in lung in rats with diabetic nephropathy, so as to explore the the regulating mechanism of Salvia miltiorrhiza monomer IH764-3 for body fluid metabolism abnormality. Methods 60 healthy SD rats were selected, among which ten as control group, and the other 50 ones were used to establish diabetes model by high glucose and lipoids feeder and low-dose STZ. They the successful models (n=30) were randomly divided into 3 groups: model group, control group and study group, with 10 rats in each group. The control group was given captopril by gavage, study group was given captopril by gavage combined with IH764-3 by intraperitoneal injection, normal group and control group were given distilled water at the same dose. After 16 weeks’ treatment, the rats were killed to get their lung and renal tissue for pathological observation. The expression of protein and mRNA of AQP2,AQP4 in renal tissue and AQP1 in lung tissue were detected by immunohistochemistry method, Western blot method, RT-PCR method. Results The expression of protein and mRNA of AQP2 and AQP 4 in renal tissue in model group was higher than that in normal group (P<0.05), and that in control group and study group was lower compared with the model group (P<0.05), in study group was lower compared with control group (P<0.05). The expression of protein and mRNA of AQP1 in lung tissue in model group was lower than that in normal group (P<0.05),there was no significant difference in the indexes between study group and normal group (P>0.05), control group and model group (P>0.05). Conclusion The increase of AQP2 expression in renal tissue and decrease of AQP1 expression in pulmonary tissue may be one of the important mechanism which could induce body fluid metabolism abnormality. Salvia miltiorrhiza monomer IH764-3 had regulatory effect on AQP expression, which may be the mechanism it regulates body fluid metabolism as well as the basis for preventing and treating diabetes.

Key words:diabetic nephropathy Aquaporin；Salvia miltiorrhiza monomer IH764-3；Streptozotocin

[收稿日期]2015-09-03

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)07-0693-06

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.07.003

[基金项目]全军青年培育项目(13QNP187)

[作者简介]胡波，男，主治医师，研究方向为糖尿病肾病的防治。