王芸姣　韩文祺　李若菲　杜尊赎　王学江　江　瑛

(首都医科大学基础医学院生理学与病理生理学系病理生理学教研室，北京 100069)



AMPK参与调节大鼠脂肪肝相关性肝癌前病变的形成

王芸姣韩文祺李若菲杜尊赎王学江江瑛*

(首都医科大学基础医学院生理学与病理生理学系病理生理学教研室，北京 100069)

【摘要】目的 探讨单磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)在低剂量二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine, DEN)合并高脂饮食诱导的大鼠肝癌前病变发生中的作用及其机制。方法体内实验采用腹腔注射DEN(30 mg/kg)合并高脂饮食饲喂大鼠16周诱导肝癌前病变模型，通过HE染色、Western blotting、Real-time PCR、免疫组织化学等方法观察谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase-π,GST-π)、固醇调节元件结合蛋白1c(sterol regulatory element binding protein-1c, SREBP-1c)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)、乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1(stearoyl-CoA desaturase 1,SCD1)及AMPK、p-AMPK的表达变化；体外实验观察AMPK对棕榈酸(palmitic acid, PA)诱导的大鼠H4IIE细胞脂质代谢的影响。结果与单纯DEN处理组比较，DEN+高脂组大鼠肝细胞脂肪变性、气球样变、伴有炎性细胞浸润及小灶性坏死；GST-π表达水平增高；三酰甘油(triglyceride，TG)及SREBP-1c、FAS、ACC、SCD1表达水平上升；p-AMPK水平下降。 AMPK通过抑制SREBP-1c的表达水平降低棕榈酸诱导的H4IIE细胞内脂质合成。结论AMPK可能通过抑制SREBP-1c的表达水平参与大鼠肝癌前病变的形成。

【关键词】二乙基亚硝胺；非酒精性脂肪性肝炎； 肝癌前病变；单磷酸腺苷活化蛋白激酶AMPK；固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP-1c)

随着人们生活水平的提高，因高脂高糖等不良饮食习惯导致的非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)成为我国仅次于病毒性肝炎的第二大肝病[1]。NAFLD是以肝细胞脂肪变性为病理特征而患者无过量饮酒史的临床综合征，按照其病理学改变分为单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎 (nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纤维化和肝硬化4个阶段，并可进展为肝癌和肝衰竭[2]。近年来，脂肪性肝病与肝癌的关系日益引起世界的关注[3]，研究[4]报道脂肪性肝炎可以不依赖于脂肪性肝炎-肝硬化-肝癌的发病模式而直接进展为肝癌。动物实验[5-6]的研究结果表明，无论是遗传性肥胖的ob/ob小鼠还是高脂饮食诱导的脂肪肝小鼠或NASH大鼠，脂肪肝和脂肪性肝炎均可促进肝癌或肝癌前病变的形成，但是关于脂肪肝相关性肝癌的发生机制尚不十分清楚。腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK)是一种在真核细胞中广泛表达的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，研究[7]证实磷酸化的AMPK可降低肝脏内三酰甘油(triglyceride，TG)堆积，AMPK的磷酸化程度与肝癌的进展和预后呈现一定相关性[8]。但是AMPK与脂肪肝相关性肝癌前病变的关系，至今尚不明确。本研究利用低剂量二乙基亚硝胺合并高脂饮食诱导大鼠脂肪肝相关性肝癌前病变模型[6]，试图探讨AMPK在脂肪肝相关性肝癌前病变形成中的作用。

1材料与方法

1.1主要试剂

兔抗鼠GST-π多克隆抗体购自MBL公司(日本)；兔抗鼠SREBP-1c多克隆抗体购自Santa Cruz公司(美国)；兔抗鼠FAS、 ACC、 SCD1、AMPK、p-AMPK多克隆抗体均购自Cell Signaling Technology公司(美国)；免疫组化试剂盒购自中杉金桥公司(中国)； TG试剂盒购自普利莱公司(中国)； Real-time PCR 试剂盒购自Promega公司(美国)；引物根据Genbank数据库设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine, DEN)、棕榈酸(palmitic acid, PA)、5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-D-ribofuranoside(AICAR)购自Sigma公司(美国)；无脂肪酸牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)购自WAKO公司(日本)。

1.2动物及分组

雄性 SD大鼠30只，6周龄，体质量120 ～140g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号:SCXK(京) 2012-00011；高脂饲料购自军事医学科学院(基础饲料88%, 猪油 10%, 胆固醇 2%)。采用数字表法将大鼠随机分为对照组(DEN+正常饲料组)和模型组(DEN+高脂组)。对照组动物腹腔注射30 mg/kg的DEN后给予普通饮食，而模型组动物腹腔注射30 mg/kg的DEN后给予高脂饮食；每周记录一次体质量变化，16周后造模结束，于取材前24 h空腹，10%(质量分数)的水合氯醛腹腔麻醉(3 mL/kg)，手术快速收集肝脏标本。

1.3细胞及分组

大鼠肝癌细胞H4IIE购自中国协和医科大学细胞库，细胞根据处理方式不同分为BSA组、PA刺激组、AICAR组及AICAR+PA刺激组。PA浓度为200 μmol/L，刺激时间为24 h；AICAR浓度为1 mmol/L, 刺激时间为24 h。

1.4方法

1)肝组织病理学：5μm厚度的石蜡切片，行HE染色，光学显微镜下观察肝组织结构；按照PV-9001二步法行GST-π免疫组织化学染色，光学显微镜下观察肝癌前病变。

2)Real-time PCR：采用Trizol提取肝组织总RNA，利用Promega反转录试剂盒将其反转录为cDNA，利用实时荧光定量PCR方法检测SREBP-1基因和内参基因18S的表达水平。引物序列：SREBP-1c上游：5′-GCA ACA CTG GCA GAG ATC TAC GT-3′；下游：5′-TGG CGG GCA CTA CTC AGG AA-3′；18S上游：5′-GTA ACC CGT TGA ACC CCA TT-3′，下游：5′-CCA TCC AAT CGG TAG TAG CG-3′。PCR条件为：95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s;60 ℃ 30 s;72 ℃ 30 s共 40 循环。以18S为内参，用2ΔΔCt计算mRNA表达。

3)Western blotting:用含蛋白酶抑制剂的裂解液裂解组织或细胞蛋白，按30～50μg的蛋白量加样，经SDS-PAGE电泳后，低温恒压电转至PVDF膜上，5%(质量分数)脱脂奶粉封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜(SREBP-1c：1∶1 000，ACC：1∶1 000，FAS：1∶1 000，SCD1：1∶1 000，p-AMPK:1∶1 000，AMPK：1∶1 000，GST-π：1∶2 000，β-actin：1∶3 000)，加入鼠抗兔HRP标记的二抗(1∶5 000)，室温下孵育1 h，ECL化学发光， Image J进行定量分析。

4)三酰甘油(triglyceride，TG)测定：采用 GPO-PAP 法测定，按照三酰甘油测定试剂盒提供的操作方法进行，方法如下：加入裂解液，冰上进行组织破碎匀浆， 37 ℃保温 5 min，在500 nm波长下测定吸光度值。

5)棕榈酸(PA)与无脂肪酸BSA的连接：用0.1 mol/L NaOH皂化PA储存液(100 mmol/L)后，置于80 ℃水浴锅中30 min，之后与10%(质量分数)无脂肪酸BSA混合，该体系中PA与BSA的比值为3.5∶1。

1.5统计学方法

数据以 SPSS17. 0 统计学软件进行分析，两组比较采用Student’st检验，多组比较采用单因素方差分析和均数多重比较方法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结 果

2.1脂肪性肝炎促进DEN启动的大鼠肝癌前病变的形成

与对照组比较，模型组肝细胞排列紊乱，细胞出现明显的脂肪变性、气球样变及小灶性坏死，并可见大量炎性细胞浸润(图1A)。免疫组织化学染色的结果显示，肝癌前病变的标志物GST-π蛋白[9]在对照组仅见散在的单个细胞表达，而模型组肝组织中GST-π蛋白表达明显增加，呈小灶状分布(连续阳性细胞的数量不少于6个)[6](图1A)；Western blotting的结果表明，模型组肝脏GST-π蛋白表达较对照组明显增高(P<0.05)(图1B)，上述结果提示高脂饮食诱导的脂肪性肝炎促进了低剂量DEN启动的大鼠肝癌前病变模型的形成。两组动物的体质量和肝系数指标差异无统计学意义。

图1　脂肪性肝炎促进DEN启动的大鼠肝癌前病变的形成

A.a&b:HE staining (Scale bar: 50 μm); c&d:IHC staining of GST-π (Scale bar:100 μm); B:Western blotting of GST-π expression.*P<0.05vsDEN group,n=8; GST-π: glutathione S-transferase-π; DEN: diethylnitrosamine; HFD:high fat diet.

2.2脂肪肝相关性肝癌前病变的大鼠肝组织p-AMPK蛋白表达水平降低

与对照组比较，低剂量DEN+高脂饮食诱导的脂肪肝相关性肝癌前病变模型组肝脏p-AMPK蛋白的表达水平降低(P<0.05)，总AMPK未见明显变化(图2)，提示AMPK信号通路可能参与了脂肪肝相关性肝癌前病变的发生。

2.3脂肪肝相关性肝癌前病变的大鼠肝脏TG浓度及SREBP-1c、FAS、ACC、SCD1的表达水平明显增加

与对照组相比，低剂量DEN+高脂饮食诱导的脂肪肝相关性肝癌前病变模型组大鼠肝脏TG浓度明显升高(P<0.001)(图3A)，脂肪酸合成的关键因子SREBP-1c在mRNA(P<0.01)(图3B)及蛋白(P<0.05)(图3C、D)浓度显著上升，其下游靶基因FAS(P<0.01)、ACC(P<0.05)、SCD1(P<0.05)蛋白浓度也明显升高(图3C)，表明脂肪肝相关性肝癌前病变的大鼠肝脏的脂质堆积可能与其脂肪酸合成增加有关。

图2　脂肪肝相关性肝癌前病变大鼠肝组织p-AMPK的表达

*P<0.05vsDEN group,n=8. AMPK: adenosine monophosphate-activated protein kinase; DEN: diethylnitrosamine; HFD:high fat diet.

图3　脂肪肝相关性肝癌前病变的大鼠肝脏TG浓度及SREBP-1c、FAS、ACC、SCD1的表达

A: TG content measurement; B: mRNA level of SREBP-1c; C, D: protein levels of SREBP-1c、 FAS、ACC、SCD1.*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vsDEN group.n=8; TG: triglyceride; SREBP-1c: sterol regulatory element binding protein-1c; FAS: fatty acid synthase; ACC: acetyl-CoA carboxylase; SCD1: stearoyl-CoA desaturase 1; DEN: diethylnitrosamine; HFD:high fat diet.

2.4 AMPK通过抑制SREBP-1c的表达而降低棕榈酸诱导的脂质合成

Western blotting 结果显示，棕榈酸可诱导H4IIE细胞脂质堆积，引起TG(P<0.01)(图4A)、SREBP-1c(P<0.001)、FAS(P<0.01)、ACC(P<0.01)、SCD1(P<0.001)蛋白表达水平上升(图4B)；给予AMPK激动剂AICAR后，TG浓度下降(P<0.05)(图4A)，SREBP-1c(P<0.01)、FAS(P<0.05)、ACC (P<0.01)、SCD1(P<0.001)蛋白浓度降低(图4B)。表明AMPK可通过SREBP-1c而调节棕榈酸诱导的肝癌细胞脂质堆积。

图4　AMPK通过抑制SREBP-1c的表达而降低棕榈酸诱导的脂质合成

A: TG content among different groups; B: protein levels of SREBP-1c,FAS,ACC,SCD1.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.n=3; AMPK: adenosine monophosphate-activated protein kinase; TG: triglyceride; SREBP-1c: sterol regulatory element binding protein-1c; FAS: fatty acid synthase; ACC: acetyl-CoA carboxylase; SCD1: stearoyl-CoA desaturase 1; BSA: bovin serum albumin; PA: palmitic acid; AICAR:5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-D-ribofuranoside.

3讨论

肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC) 是全球第7位常见的恶性肿瘤，其发病隐匿，进展迅速，且愈后凶险，在全世界肿瘤患者病死率中高居第3位。研究[10]证实肝癌的发生与肝炎病毒感染、肥胖、酒精性/非酒精性脂肪肝、肝硬化等因素相关。文献[11-12]报道肥胖可促使肝癌发生率增加1.5～4.5倍， 近年来，非酒精性脂肪肝的发病率呈逐渐升高的趋势，研究[13-14]报道40%～62%的NASH患者在历时5～7年的随访中逐渐发展为肝硬化及肝癌。动物试验的研究[5]结果表明，饮食诱导的脂肪肝小鼠常伴随白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎性反应因子的上升，并在一定程度上促进肝癌的发生。Wang等[6]发现，高脂饮食可促进低剂量DEN诱导的大鼠肝癌前病变形成，伴有明显的炎性细胞浸润和NF-κB通路的激活，推测脂肪性肝炎可能通过活化NF-κB调控cyclin D1而促进肝癌前病变的形成[15]。本研究结果显示，DEN+高脂组肝脏GST-π表达较单纯DEN组明显升高，伴有明显的细胞脂肪变性、气球样变性、炎细胞浸润、灶性坏死等脂肪性肝炎的表现，这些结果与 Wang等[6]一致，证实高脂饮食导致的脂肪性肝炎可以促进肝癌前病变的形成。

AMPK信号通路在调节糖类、脂肪代谢及能量调控方面发挥了重要作用[16]。研究[3, 7]证实AMPK可在多靶点缓解NASH的病变程度，AMPK可通过下调mTORC1、抑制LXR的转录以及上调PPARα等途径，从而降低脂肪酸合成或增加脂肪酸氧化；此外，AMPK与肿瘤的发生发展也有密切的关系[17]。AMPK参与了乳腺癌、肺癌、肝癌等疾病的发生[18-20]。肝癌组织p-AMPK的浓度较癌旁组织明显降低，且AMPK的磷酸化和肿瘤组织大小呈明显负相关[20]，提示AMPK可能在一定程度上抑制肝癌的发生。但AMPK是否在肝癌前病变中也发挥了一定作用，尚未见报道。本实验结果表明，脂肪肝性肝癌前病变组织p-AMPK蛋白水平较单纯DEN组下降，提示AMPK可能参与脂肪肝性肝癌前病变的形成。

SREBP-1c作为肝脏脂肪合成过程中重要的转录调节因子，可通过调节其下游脂肪酸合成靶基因，如FAS、ACC、SCD1的表达，参与NASH的发生发展[21]。已知SREBP-1c受mTORC1、LXR及AMPK等信号分子的调控，Park等[7]发现，AMPK可通过下调SREBP-1c的表达而减轻脂肪性肝病的程度。最近的研究[22]表明， SREBP-1c在人的肝癌组织中表达较癌旁组织增高，且其表达程度与TNM分期、肿瘤体积、生存时间均呈现一定相关性。本研究结果表明，脂肪肝性肝癌前病变大鼠肝脏SREBP-1c及其靶基因FAS、ACC、SCD1升高，推测SREBP-1c可能参与了脂肪肝性肝癌前病变的发生过程。本研究结果表明，棕榈酸导致H4IIE细胞三酰甘油浓度增加，伴有SREBP-1c及其靶基因FAS、ACC、SCD1的蛋白浓度升高，AMPK通过降低SREBP-1c及其靶基因FAS、ACC、SCD1的蛋白浓度减少了棕榈酸诱导H4IIE细胞内的脂质沉积。上述结果提示AMPK可能通过抑制SREBP-1c的表达而参与了低剂量DEN合并高脂饮食诱导的肝癌前病变的形成。

本实验结果首次证实了AMPK信号调节通路可能通过调节SREBP-1c等脂肪酸合成因子参与了低剂量DEN合并高脂饮食诱导的肝癌前病变的发生，为进一步探讨脂肪肝性肝癌前病变发生发展的分子机制提供了新的思路。

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编辑陈瑞芳

Adenosine monophosphate-activated protein kinase involved in early hepatocarcinogenesis associated with nonalcoholic steatohepatitis in rats

Wang Yunjiao, Han Wenqi, Li Ruofei, Du Zunshu, Wang Xuejiang, Jiang Ying*

(DivisionofPathophysiology，DepartmentofPhysiologyandPathophysiology，SchoolofBasicMedicalSciences,CapitalMedicalUniversity，Beijing100069，China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the role of adenosine monophosphate-activated protein kinase(AMPK) in the development of precancerosis induced by a high-fat diet and diethylnitrosamine and its molecular mechanism.MethodsThe low dose of diethylnitrosamine(DEN,30mg/kg,ip) and high fat diet(16 weeks)induced liver precancerosis of rat model in vivo was established to observe the pathological changes of rat livers by HE staining.The expression levels of glutathione S-transferase-π(GST-π),sterol regulatory element binding protein-1c (SREBP-1c),fatty acid synthase (FAS),acetyl-CoA carboxylase (ACC),stearoyl-CoA desaturase 1(SCD1),AMPK,p-AMPK were detected by Western blotting, Real-time PCR and immunohistochemistry. The rat cells H4IIE were disposed by palmitic acid(PA) to mimic lipid overload in hepatocarcinoma cells and evaluate the role of AMPK in modulating fat metabolism of hepatocarcinoma.ResultsWe found lipid droplets overload evidently in hepatocytes of rats in DEN+HFD group compared with DEN group, some of which behaving ballooning change,necrosis and inflammatory; meanwhile,GST-π and triglyceride(TG) expression were both elevated significantly in the livers of rats treated with DEN+HFD group when compared with that of DEN group, indicating the precancerosis of rat model induced by NASH was successful.Similarly, the expression of SREBP-1c and its target genes FAS,ACC,SCD1 were all elevated statistically. Furthermore, p-AMPK level was decreased. The in vitro model indicated that TG,SREBP-1c, FAS,ACC,SCD1 were all increased in PA treated cells, while treating cells with AICAR,activator of AMPK,can reverse the effect of PA. ConclusionAMPK is involved in liver precancerosis induced by high-fat diet and diethylnitrosamine, and this process may happen through the inhibition of SREBP-1c.

【Key words】diethylnitrosamine; non-alcoholic steatohepatitis; liver precancerosis; adenosine monophosphate-activated protein kinase; sterol regulatory element binding protein-1c

(收稿日期：2016-01-12)

【中图分类号】R 575.5

[doi：10.3969/j.issn.1006-7795.2016.02.019]

*Corresponding author， E-mail：jiangy@ccmu.edu.cn

基金项目：国家自然科学基金(81070319)，北京市自然科学基金(710201)，北京市中医药科技发展资金(JJ2013-02)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81070319), Natural Science Foundation of Beijing (7102013), Beijing Traditional Chinese Research Program (JJ2013-02).

网络出版时间：2016-04-1314∶41网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20160413.1441.002.html

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