邓楚钟, 潘耀振

(贵州医科大学附院 肝胆外科， 贵州 贵阳　550001)



同源重组与Gibson Assembly方法构建腺病毒载体*

邓楚钟, 潘耀振*

(贵州医科大学附院 肝胆外科， 贵州 贵阳550001)

[摘要]目的： 对比同源重组与Gibson Assembly两种方法构建腺病毒载体的效率。方法： 增殖并提取AD4 DNA，分别用同源重组与Gibson Assembly两种方法，将AD4 DNA镶嵌入pBR322质粒，构建出携带有全长AD4 DNA的腺病毒载体，并进行PCR和测序鉴定，对比两种方法构建腺病毒载体的筛选效率。结果： 两种方法均能构建出正确的腺病毒载体；筛选同源重组法1 000个菌落中，鉴定360个，仅有1个菌落；Gibson Assembly法112个菌落数中，鉴定其中10个，有3个阳性。结论： Gibson Assembly方法比传统同源重组方法在构建腺病毒载体时更有效。

[关键词]腺病毒； 疫苗； 重组载体； Gibson Assembly

腺病毒是一种无包膜的双链DNA病毒，分子量为150 MDa，直径约为950 Å，它是已知最大和最复杂的无包膜DNA病毒之一[1]。腺病毒广泛存在于自然中，能通过呼吸道、消化道、眼黏膜等途径感染动物和人，无论增殖和非增殖细胞均可以被感染，但对人类的致病性低。由于腺病毒和人类基因组同源，感染后不会整合到人染色体中，不会导致染色体突变。因此，将腺病毒作为抗原呈递载体构建疫苗，具有高效、安全、给药方便的优点，可以激发机体天然免疫反应，同时便于保存及成本易控[2-9]，这些优势使得腺病毒载体成为疫苗研究的热点。同源重组方法构建腺病毒载体是目前公认的效率较高的方法，但由于受到36 Kd腺病毒DNA碱基数量过大影响，实际效率不高。Gibson Assembly方法是近些年由Dr. Daniel Gibson发明了一种新的方法，可以容易的将多个线性DNA片段组合到一起。……