毛久凤， 夏　茜， 吴　镭， 杨　红， 周成菊， 方　艺， 董　强*

(1.贵州医科大学口腔医学院 口腔修复学教研室， 贵州 贵阳　550004； 2.贵州医科大学附属口腔医院 口腔内科， 贵州 贵阳　550004； 3.贵阳市口腔医院， 贵州 贵阳　550004； 4.贵州医科大学 病理学教研室， 贵州 贵阳　550004)



不同表面处理方法对钛表面成骨细胞膜片ALP活性的影响*

毛久凤1**， 夏茜2， 吴镭1， 杨红3， 周成菊3， 方艺4， 董强1***

(1.贵州医科大学口腔医学院 口腔修复学教研室， 贵州 贵阳550004； 2.贵州医科大学附属口腔医院 口腔内科， 贵州 贵阳550004； 3.贵阳市口腔医院， 贵州 贵阳550004； 4.贵州医科大学 病理学教研室， 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 探讨不同表面处理方法对钛表面的成骨细胞膜片碱性磷酸酶(ALP)活性的影响。方法： 原代培养大鼠成骨细胞，通过形态学及ALP鉴定成骨细胞；以机械抛光处理的钛片为对照组，以棕刚玉颗粒喷砂材料处理的钛片为喷砂酸蚀(SLA)组，分别构建成骨细胞膜片，膜片连续培养1周或2周时，测量成骨细胞膜片中反映成骨效应的ALP活性的改变。结果： 原代培养细胞ALP阳性，经形态及特性鉴定为成骨细胞；连续培养1周或2周时，SLA组ALP活性均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；各组膜片ALP活性第1周高于第2周，差异有统计学意义(P<0.05)。结论： 钛表面性质能够影响成骨细胞膜片的成骨分化能力。

[关键词]细胞膜片； 钛； 表面处理； 碱性磷酸酶； 细胞培养； 大鼠，Sprague Dawley

目前，利用组织工程技术促进骨再生是口腔种植研究领域的热点之一。细胞膜片技术(cell sheet technology，CST)作为组织工程技术的一种新方法，已应用于重建角膜、心肌、肾脏、血管、及骨等多种组织[1-3]。钛及其合金已广泛用于口腔种植领域，这些材料可以和骨组织之间形成直接接触，即所谓的“骨整合”。钛种植体的表面特性是影响骨整合的关键因素之一，粗糙钛表面能诱导成骨细胞增殖，增加碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase，ALP)活性，增强细胞的分化能力[4-5]。喷砂酸蚀(sand blasted,larged-grit,acid-etched,SLA)技术是钛表面改性中较常用的方法，能使钛表面成骨细胞的ALP活性以及培养液中的骨钙素的含量增加。钛表面性质是否影响细胞膜片的成骨功能，目前尚不清楚。本实验通过在机械抛光和SLA处理的钛表面分别构建成骨细胞膜片，观察成骨细胞膜片中ALP的活性变化，初步研究成骨细胞膜片在不同钛表面的成骨效应。

1材料方法

1.1主要试剂和仪器

DMEM高糖培养基(HyClone，美国)、胎牛血清(杭州四季青)、青链霉素(美国)、胰蛋白酶(HyClone，美国)、Ⅰ型胶原酶(Gibco，美国)、抗坏血酸(Solarbio，Sigma Ultra，美国)、超净工作台、恒温培养箱、离心机、倒置相差显微镜及照相系统、24孔培养板(Corning-Costar，美国)、钛片(西安泰金工业电化学技术有限公司)。

1.2方法

1.2.1钛片的制备采用二级工业纯钛片(厚1 mm，直径15 mm)，用500、800及1 200号的金相砂纸打磨，使用丙酮清洗钛片180 s。实验分为对照组和SLA组。对照组采用机械抛光处理，喷砂酸蚀(SLA)组以棕刚玉颗粒为喷砂材料，120 v电压作用于钛表面，喷砂完成后，0.11 mol/L的氢氟酸和0.09 mol/L硝酸溶液室温下作用10 min，超声清洗。各组试件均用去离子水冲洗，依次经丙酮、75%酒精、蒸馏水(dH2O)处理15 min，室温干燥1 h高压灭菌备用。

1.2.2成骨细胞培养和鉴定取新生24 h的 SD大鼠乳鼠颅骨，用含双抗的预冷PBS洗3次，刮净骨膜结缔组织，剪碎骨片。加入含0.25%乙二胺四乙酸(EDTA)的胰蛋白酶消化15 min后弃消化液，使用0.1%Ⅰ型胶原酶37 ℃消化骨碎片约20 min，重复3次，收集消化液，1 000 r/min离心5 min，差数贴壁法获取成骨细胞，纯化并传代。取第3代细胞，显微镜下观察细胞形态、同时行ALP染色(钙钴法)，鉴定成骨细胞。

1.2.3细胞膜片的构建以1×106个/孔细胞数将第3代成骨细胞分别接种于24孔板内的对照组和SLA组钛表面。DMEM完全培养基(15%的胎牛血清、50 mg/L维生素C、1 000 U/L青霉素-链霉素)连续培养；每2 d换液1次。分别于培养第7天和第14天时检测成骨细胞的ALP活性。

1.2.4ALP活性使用ALP测试盒(酶标仪法)参照试剂盒说明书检测膜片的ALP活性。分别收集已连续培养1周或2周时接种于钛片上的成骨细胞培养液，1 500 r/min，离心10 min，取上清进行测定，依次加入缓冲液、基质液50 μL，充分混匀后37 ℃水浴1 min。加入显色剂150 μL，轻轻混匀，于490 nm酶标仪测定各孔吸光度吸光度(OD)值，按公式计算ALP活性(以100 mL液体在37 ℃与基质作用15 min产生1mg酚为1个金氏单位)[7]。

ALP活力(金氏单位/100 mL)=测定OD值-空白OD值/标准OD值-空白OD值×酚标准品浓度×100 mL×样本测定前稀释倍数

1.3统计学分析

2实验结果

2.1成骨细胞鉴定

倒置显微镜下可见分离、接种的细胞4～5 h时细胞开始贴壁。原代培养7～8 d时细胞单层融合贴壁生长，呈长梭形、星形及多角形(图1A)。对细胞进行纯化传代，细胞保持较强的增殖活性，形态均一，呈短梭形或三角形，可见大的细胞核(图1B)。ALP染色后显微镜下见细胞质中呈灰黑色颗粒、块状、条状沉淀，核呈紫色 (图1C-D)。

2.2细胞膜片

细胞刮可从钛表面获得白色膜状物，具有一定的韧性，可卷缩成团(图2A)。倒置显微镜下观察膜片由细胞与细胞外基质构成，细胞与细胞间连接紧密(图2B)。

注：A为成骨细胞原代培养第8天(100×) ，B为成骨细胞第三代培养第4天(100×)，C、 D为成骨细胞第三代培养后ALP染色(C:100×; D:200×)图1　成骨细胞形态和ALP染色Fig.1　The morphology and ALP staining of osteoblasts

注：A为肉眼，B为倒置显微镜(100×)图2　成骨细胞膜片Fig.2　osteoblast cell sheet

2.3ALP活性

连续培养1周或2周时，SLA组ALP活性均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；1周形成膜片ALP活性高于2周，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1　两组膜片中ALP活性

(1)与对照组比较P<0.05，(2)与1周比较P<0.05

3讨论

钛及其合金作为口腔种植及骨科植入材料，由于钛本身具有的机械强度、耐腐蚀性等优点，具有良好的生物相容性。钛表面存在大量细胞外基质蛋白有助于细胞的黏附[8]。组织工程细胞膜片的应用能够避免外源支架引起的炎症反应、细胞利用率低等问题，近年来利用CST促进骨组织再生的方法成为人们研究的热点。可以通过温度反应培养皿法、胶原凝胶法、物理刮取法等方法构建的细胞膜片，它保留细胞自身分泌的细胞外基质，为细胞的生存、功能的发挥提供较稳定的微环境[9-12]。细胞膜片不仅保留了细胞与细胞间的连接、还有细胞与细胞外基质的连接来维持着细胞的功能表型及结构的完整性。完整的细胞与细胞外基质对调控细胞的黏附、增殖、分化能力具有重要作用。

钛表面性质对种植体与宿主骨之间的生物作用有影响。粗糙度的增加有助于成骨细胞的黏附、增殖及成骨相关基因的表达[7]。钛表面的湿润度是增强细胞黏附的重要因素之一，有研究发现，钛表面湿润度增加促进了钛种植体与周围组织的整合。作为细胞矿化、骨化的标志酶，ALP活性不仅能反映细胞的生长状况，还能作为细胞成骨分化的早期标志[7]。本研究中，采用无支架成骨细胞膜片骨组织工程方法，在两种钛表面构建成骨细胞膜片，光滑钛表面形成的细胞膜片可通过物理刮取法分离，而SLA组通过喷砂处理后的钛表面粗糙度增加，增加了与细胞膜片的接触面积；进一步酸蚀使喷砂后表面的杂质去除的同时，强酸的作用使钛表面形成微孔隙，亲水性钛表面增加了钛的湿润度，粗糙的表面、湿润度的增加最终促进细胞膜片的黏附、增殖及分化。因此，本研究对钛表面成骨细胞膜片的ALP活性检测时发现，组内比较时，1周形成的成骨细胞膜片ALP含量较2周ALP含量高，提示随着培养时间的延长，ALP会有所降低，进一步证实了ALP是细胞成骨分化的早期标志；而在组间比较时，SLA组ALP含量较光滑对照组ALP含量明显增高，提示钛表面形成的膜片层结构内成骨细胞可能处于分化早期向细胞分化、成熟阶段过渡。综上，钛表面改性增强了细胞膜片的黏附及分化能力，SLA的钛表面能够有效的黏附细胞膜片，触发细胞膜片早期分化，有关的作用机制有待进一步的研究。

4参考文献

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(2016-01-05收稿，2016-03-26修回)

中文编辑： 吴昌学； 英文编辑： 赵毅

Active Changes of ALP of Osteoblasts Cell Sheet with Different Treated Titanium Surfaces

MAO Jiufeng1, XIA Qian2, WU Lei1, YANG Hong3, ZHOU Chengju3, FANG yi4, DONG qiang1

(1.DepartmentofProsthodontics,theSchoolofStomatology,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofOralMedicine,theStomatologicalHospitalAffiliatedtoGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.GuiyangStomatologicalHospital,Guiyang550004,Guizhou,China; 4.DepartmentofPathology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To study the ontogenesis of osteoblasts cell sheets with different treated surface of titanium. Methods: Primary cultured rat osteoblasts were identified through morphology observation, alkaline phosphatase staining. Mechanically polished titanium sheets served as control group. The cell sheets were treated with brown fused alumina material as SLA group. Constructing osteoblast cell sheets respectively, and cultured successively for 1 or 2 weeks. Then, measuring changes of ALP activity. Results: Primary cultured cell ALP was positive, the morphology of cells conformed to the characteristics of osteoblasts. The alkaline phosphatase activity of the SLA group was higher than that of control group when cultured successively for 1 or 2 weeks, differences were statistically significant (P<0.05). The alkaline phosphatase activity of the cell sheets formed in 1stweek was higher than that of 2ndweek, differences were statistically significant (P<0.05). Conclusion: The surface properties of titanium could affect the osteogenic capacity of cell sheet.

[Key words]cell shee; titanium; surface treatment; alkaline phosphatase; cell culture; rats, Sprague-Dawley

[中图分类号]R783； R318.021

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2016)04-0410-04

*[基金项目]贵州省科技厅省校合作协议项目[黔科合LH字(2014)7115]； 贵阳市科技计划项目[筑科合同(2014)100139]

**贵州医科大学2013级硕士研究生

***通信作者 E-mail:dongq666@163.com

网络出版时间：2016-04-20网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160420.1817.024.html