硫化氢对创伤应激引起大鼠急性肝损伤的作用

2016-05-27岑新海张志湘王艳莎季英磊谷振勇南通大学医学院法医学系江苏南通600苏州大学医学部江苏苏州53

法医学杂志 2016年2期

岑新海，张志湘，王　涛，王艳莎，季英磊，闫　骏，谷振勇（.南通大学医学院法医学系，江苏南通600；.苏州大学医学部，江苏苏州53）

岑新海1，2，张志湘2，王涛1，王艳莎1，季英磊1，2，闫骏1，2，谷振勇1，2
（1.南通大学医学院法医学系，江苏南通226001；2.苏州大学医学部，江苏苏州215123）

摘要：目的探讨硫化氢（H2S）在挤压大鼠后肢致急性肝损伤过程中的作用。方法将大鼠随机分为对照组、挤压组、H2S供体硫氢化钠（NaHS）+挤压组、H2S生成抑制剂炔丙基甘氨酸（propargylglycine，PAG）+挤压组。用标准重物挤压大鼠后肢建立急性肝损伤模型，分别于挤压结束后30、120min处死大鼠。比色法检测血清天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性，化学法检测大鼠血浆H2S、肝组织丙二醛（malondialdehyde，MDA）、蛋白质羰基、谷胱甘肽（glutathion，GSH）含量和H2S生成酶胱硫醚γ－裂解酶（cystathionineγ－lyase，CSE）活性，RT－PCR半定量检测肝组织CSE mRNA的表达。结果挤压大鼠后肢可引起血清AST、ALT活性增高，肝组织MDA、蛋白质羰基含量增加及GSH含量降低，血浆H2S含量减少，肝组织CSE活性降低、CSE mRNA表达下降。预先给予NaHS可显著减轻、而PAG明显加剧挤压后肢所致上述肝损伤改变。结论H2S生成减少参与介导创伤应激引起的大鼠急性肝损伤。

关键词：法医病理学；创伤和损伤；肝；应激；硫化氢；大鼠

硫化氢（H2S）是一种有臭鸡蛋气味的有毒气体。在法医学领域，以往多关注H2S的毒理学效应。研究已确证在机体转硫代谢过程中存在内源性H2S生成［1］，肝是内源性H2S生成和代谢的主要器官［2］，胱硫醚γ－裂解酶（cystathionineγ－lyase，CSE）是肝内源性H2S生成的重要来源［3］。H2S参与内毒素血症大鼠肝损伤发生，减轻肝缺血再灌注损伤，对脂多糖引起的肝细胞损伤具有调节作用［4－7］。研究［8］发现，创伤应激能诱导急性肝损伤，氧化应激可能是重要发病途径。本实验用大鼠软组织挤压导致急性肝损伤模型，通过人为控制H2S的含量观察H2S在创伤诱导急性肝损伤中的作用，并着重探讨其对氧化应激的调节作用。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

H2S供体硫氢化钠（NaHS）、H2S生成抑制剂炔丙基甘氨酸（propargylglycine，PAG）、N，N－二甲基－对苯二胺硫酸盐、L－半胱氨酸、5'－磷酸吡哆醛为美国Sigma公司产品，丙二醛（malondialdehyde，MDA）、蛋白质羰基、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和考马斯亮蓝检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，RNA提取试剂Trizol购自美国Invitrogen公司，AccessQuickTMRT－PCR试剂盒为美国Promega公司产品，醋酸锌、三氯化铁、三氯醋酸均为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1急性肝损伤大鼠模型的建立与分组

健康Sprague－Dawley（SD）大鼠84只，体质量180～200 g，清洁级，雌雄不限，由苏州大学实验动物中心提供。将84只大鼠随机分为6组，每组14只。

挤压组：大鼠用4%水合氯醛（35mg/kg）腹腔注射麻醉，俯卧位，双后肢固定于自制带槽木台上，固定前经腹腔注射0.5mL生理盐水，于双后肢肌肉丰富部位上压12.5 kg标准重物、持续挤压5h，于挤压结束后30、120min各取7只放血处死。

NaHS+挤压组：挤压前10min经腹腔注射NaHS （28μmol/kg，溶于0.5mL生理盐水），挤压方法同挤压组。

PAG+挤压组：挤压前10min经腹腔注射PAG （45μmol/kg，溶于0.5mL生理盐水），挤压方法同挤压组。

NaHS组：双后肢固定前10min经腹腔注射NaHS （28μmol/kg，溶于0.5mL生理盐水），不予挤压后肢。

PAG组：双后肢固定前10min经腹腔注射PAG （45μmol/kg，溶于0.5mL生理盐水），不予挤压后肢。

对照组：仅于双后肢固定前经腹腔注射0.5mL生理盐水。

NaHS、PAG和对照组大鼠除不给予标准重物挤压外，麻醉、固定等同挤压组处理，持续5 h，固定前10min分别注射等剂量NaHS、PAG或等容积生理盐水，于固定结束后30、120min放血处死大鼠。留取血浆检测H2S含量；血清检测天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）活性；留取左肝叶部分肝组织，制备匀浆，检测肝组织MDA、蛋白质羰基、GSH含量，CSE活性和CSE mRNA的表达。

1.2.2血清AST、ALT活性及肝组织MDA、蛋白质羰基和GSH含量检测

按照试剂盒说明书进行操作。用比色法检测血清AST、ALT活性，单位均为U/L。制备肝组织匀浆与相应的检测试剂反应、离心，用硫代巴比妥方法检测肝组织MDA含量，在波长532nm处检测光密度，计算MDA含量（nmol/mg），用比色法检测肝组织蛋白质羰基和GSH含量，分别在波长370nm、420nm处检测光密度，计算蛋白质羰基含量（nmol/mg）和GSH含量（nmol/g）。

1.2.3血浆H2S含量测定

采用去蛋白法［9］检测H2S含量。反应在5mL玻璃试管中进行。在试管中先后加入1%醋酸锌0.5mL、血浆0.1mL，振荡混匀，使硫离子与醋酸锌充分反应形成硫化锌沉淀；再依次加入20mmol/L N，N－二甲基－对苯二胺硫酸盐0.5mL和30mmol/L三氯化铁0.5mL，室温孵育20min使之充分显色。再加入50%三氯醋酸1mL使蛋白沉淀下来，加2.5mL蒸馏水补足体积至5mL。室温下以3 000×g离心5min，吸取上清液，用ELX800酶标仪（美国BioTek公司）在波长670nm处检测上清液的光密度。用不同浓度的NaHS绘制标准曲线，根据标准曲线计算上清液中H2S的含量（μmol/L）。

1.2.4肝组织CSE活性检测

参照文献［10－11］方法，并进行适当改良。取大鼠肝组织在冰冷的磷酸钾缓冲液（50mmol/L，pH=6.8）中研磨成匀浆，4℃下4000×g离心10min，取上清液备用。反应在25mL锥形瓶中进行，反应体积1mL，其中含磷酸钾缓冲液（100mmol/L，pH=7.4）、L－半胱氨酸（10mmol/L）、5'－磷酸吡多醛（2mmol/L）共0.7mL和磷酸钾缓冲液制备的10%肝组织匀浆0.3mL。在锥形瓶中央放置容积约为2mL塑料管作为反应中央室，在中央室中加入1%醋酸锌0.5mL，并剪2.0cm×2.5 cm滤纸折叠放于中央室中以增加气－液接触面积。用氮气将锥形瓶充盈30 s后，双层石蜡膜封口。转移到37℃恒温摇床中开始反应，90min后向反应体系中注入50%三氯醋酸0.5mL终止反应，继续置于恒温摇床中。60min后将中央室内容物转移到含3.6mL蒸馏水的试管中，加入20mmol/L N，N－二甲基－对苯二胺硫酸盐（溶于7.2mol/L盐酸溶液）0.5mL和30mmol/L三氯化铁（溶于1.2mol/L盐酸溶液）0.4mL，混匀，室温孵育20min后用酶标仪在波长670nm处检测溶液光密度。肝组织CSE活性以每毫克组织在单位时间内生成H2S的量表示，单位为pmol/（min·mg）。

1.2.5RT－PCR半定量检测肝组织CSE mRNA的表达

每组随机取3只大鼠进行CSE mRNA检测。使用Trizol法提取肝总RNA，应用1%琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性，用紫外分光光度仪行RNA浓度及纯度测定，D260/D280均在1.8～2.0。大鼠CSE引物（扩增片段为400 bp）的F：5′－AGAATTCTCTCGGGGCA GTT－3′，R：5′－ACTACGTTTGGCGAGCTCAT－3′；内参GAPDH（扩增片段为262 bp）的F：5′－ACCACAGT CCATGCCATCAC－3′，R：5′－TCCACCACCCTGTTGCT GTA－3′；引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

应用AccessQuickTMRT－PCR试剂盒进行扩增。反应条件：94℃30 s，54℃30 s，72℃30 s，共30个循环。反应结束后，PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分析，采用凝胶成像分析系统计算各个条带的光密度值，以CSE与GAPDH光密度的比值表示CSE mRNA的相对表达水平。

1.3统计学处理

2　结　果

2.1血清AST及ALT活性的变化

挤压后30min和120min时，挤压组血清AST和ALT活性高于对照组（P<0.05），NaHS+挤压组相应时间点的上述指标低于挤压组（P<0.05），PAG+挤压组则高于相应挤压组（P<0.05），NaHS组和PAG组与对照组比较差异无统计学意义，见表1。

前几天乘凉时，柳红问起公公年轻时候的事，苏长河什么也不肯说。柳红对公公的过去一直充满着好奇，因为她对公公苏长河始终怀着某种特殊的情愫。乡亲们都说他年轻时英俊风流，有过好几个女人，而且还为一个女人戳瞎了自己的双眼；那个女人和苏长河生活了七年，在苏秋琴五岁、苏石一岁多的那年秋天，跟一个男人跑了，跑得无踪无影。苏长河没有去找她，他知道当一个女人的心不在自己身上时，就是找回来了还会再跑的。

表1　大鼠后肢挤压后30、120min血清AST和ALT活性变化　（n=7，±s，U/L）

注：1）与对照组比较，P<0.05；2）与挤压组比较，P<0.05

组别　AST　ALT 30min　120min　30min　120min对照　27.71±4.50　26.29±4.23　28.57±4.96　27.43±4.16挤压　84.57±12.801）　124.71±20.171）　54.43±8.161）　72.43±10.661）NaHS+挤压　65.57±8.891）2）　100.57±16.151）2）　41.86±6.311）2）　52.14±8.301）2）PAG+挤压　114.14±16.171）2）　150.14±21.611）2）　70.29±10.631）2）　130.86±23.441）2）NaHS　27.57±3.82　26.14±5.46　26.71±4.46　25.86±4.78 PAG　24.71±4.54　24.14±5.08　24.71±4.15　25.29±4.54

2.2肝组织MDA和蛋白质羰基含量的变化

挤压后30min和120min时，挤压组肝组织MDA、蛋白质羰基含量均高于对照组（P<0.05）；NaHS+挤压组相应时间点的肝组织MDA、蛋白质羰基含量明显低于挤压组（P<0.05），PAG+挤压组则均高于相应挤压组（P<0.05）；NaHS组和PAG组与对照组比较差异均无统计学意义，见表2。

2.3肝组织GSH含量的变化

挤压后30min和120min时，与对照组相比，挤压组肝组织GSH含量降低（P<0.05），NaHS+挤压组相应时间点GSH含量高于对照组（P<0.05），PAG+挤压组则低于相应对照组（P<0.05），NaHS组和PAG组与对照组比较差异无统计学意义，见表2。

2.4血浆H2S含量的变化

挤压后30min和120min时，挤压组血浆中H2S含量低于对照组（P<0.05）；与相应时间点挤压组血浆中H2S含量相比，NaHS+挤压组升高（P<0.05），PAG+挤压组降低（P<0.05）；与对照组相比，NaHS组血浆中H2S含量增高（P<0.05），PAG组H2S含量无明显变化，见表3。

2.5肝组织CSE活性的变化

与对照组相比，挤压组肝组织CSE活性降低（P< 0.05）；NaHS+挤压组肝组织CSE活性升高并高于同时间点挤压组（P<0.05），PAG+挤压组30min时无明显变化，120min时降低（P<0.05）；与对照组相比，NaHS组和PAG组CSE活性无明显变化，见表3。

表2　大鼠后肢挤压后30、120min肝组织MDA、蛋白质羰基和GSH含量变化　（n=7，±s）

注：1）与对照组比较，P<0.05；2）与挤压组比较，P<0.05

组别　MDA/（nmol/mg）　蛋白质羰基/（nmol/mg）　GSH/（nmol/g）30min　120min　30min　120min　30min　120min对照　0.72±0.14　0.76±0.22　4.11±0.49　3.95±0.52　6.80±1.04　7.20±1.19挤压　2.22±0.431）　3.07±0.471）　6.73±1.211）　8.41±1.451）　3.30±0.591）　2.34±0.691）NaHS+挤压　1.35±0.271）2）　2.04±0.281）2）　5.21±1.032）　6.89±0.971）2）　5.18±1.001）2）　6.49±1.212）PAG+挤压　3.52±0.611）2）　3.70±0.461）2）　9.66±1.741）2）　10.91±1.521）2）　2.46±0.531）　1.65±0.331）NaHS　0.74±0.14　0.87±0.16　4.31±0.80　4.59±0.78　6.28±1.11　6.78±1.26 PAG　0.80±0.23　0.81±0.15　3.95±0.92　4.11±0.58　6.68±1.08　7.18±1.99

表3　大鼠后肢挤压后30、120min血浆H2S含量及肝组织CSE活性变化　（n=7，±s）

注：1）与对照组比较，P<0.05；2）与挤压组比较，P<0.05

组别　H2S/（μmol/L）　CSE/（pmol/mg·min－1）30min　120min　30min　120min对照　174.14±14.12　181.57±12.25　353.14±55.36　353.43±31.73挤压　127.00±11.341）　129.43±23.041）　282.72±48.341）　265.29±48.831）NaHS+挤压　206.43±30.521）2）　216.86±37.601）2）　365.43±50.862）　383.14±58.432）PAG+挤压　103.86±12.521）2）　99.71±15.781）2）　232.71±35.591）　213.71±37.681）2）NaHS　220.29±19.511）　229.71±13.071）　342.43±46.87　365.14±40.29 PAG　171.00±18.15　176.29±13.94　339.86±40.82　330.86±53.55

2.6肝组织CSE mRNA表达的变化

与对照组相比，挤压组肝组织CSE mRNA表达于30min和120min时间点低于对照组（P<0.05）。NaHS+挤压组CSE mRNA表达高于同时间点挤压组（P<0.05），PAG+挤压组则低于相应时间点对照组（P<0.05）。与对照组相比，NaHS组和PAG组CSE mRNA表达量差异无统计学意义，见表4。

表4　大鼠后肢挤压后30min或120min肝组织CSE mRNA表达变化（n=3，±s，%）

注：1）与对照组比较，P<0.05；2）与挤压组比较，P<0.05

组别　30min　120min对照　47.85±6.85　49.39±7.60挤压　35.31±5.761）　38.42±7.581）NaHS+挤压　67.19±7.021）2）　64.54±4.821）2）PAG+挤压　30.48±3.081）　37.09±9.601）NaHS　52.33±7.62　54.14±5.52 PAG　48.69±7.74　60.18±6.94

3　讨　论

创伤性多器官功能障碍综合征（traumatic－multiple organ dysfunction syndrome，T－MODS）是机械性损伤常见的并发症之一。以往研究［12］证实，大面积软组织挫压伤可以引起T－MODS。T－MODS死亡率高，外伤后可以合并感染并且常常经过了临床治疗，迁延数日死亡，死亡发生涉及因素多而复杂，这导致判断TMODS死亡性质出现困难。研究T－MODS的发生机制有助于阐明外伤与死亡发生之间的因果关系，揭示TMODS的死亡性质。本实验结果首先显示，大鼠双后肢严重挫压伤导致了急性肝损伤，这与以往报道［8，13］一致。原发性外伤局限于大鼠后肢，但能引起与外伤远隔器官肝发生急性损伤，这提示创伤应激能造成包括肝在内的生命重要器官功能障碍，其机制可能为：软组织丰富的肢体受到了严重挤压作用，释放活性物质和激活损伤模式分子，引起神经内分泌免疫网络异常，从而导致远隔器官损伤；肢体局部的缺血再灌注损伤能够诱导远隔器官氧化应激和炎症反应，引起肝细胞损伤。

以往H2S一直被认为是一种有毒气体，本实验发现H2S参与了创伤应激引起的急性肝损伤。研究［1，3］表明，机体内源性H2S主要是机体含硫氨基酸转硫代谢途径生成的，5'－磷酸吡哆醛依赖性酶CSE是肝H2S的关键酶分子。业已公认H2S是继一氧化氮和一氧化碳之后被确认的第三种气体信使分子。H2S参与调节肺动脉高压、高血压、休克、心肌缺血等多种疾病的发病过程［14－16］。本实验发现，挤压大鼠后肢可导致肝功能明显异常，同时血浆H2S含量减少和肝组织CSE活性降低；预先给予腹腔注射外源性H2S供体NaHS，血清AST、ALT活性明显降低；预先给予H2S生成抑制剂PAG能进一步减少内源性H2S生成，同时挤压大鼠后肢所致的急性肝损伤明显加重，这表明内源性H2S生成减少参与介导挤压大鼠后肢所致急性肝损伤。本实验进一步探讨了H2S的作用机制，结果显示，挤压组大鼠肝组织脂质过氧化产物MDA和蛋白质过氧化分子蛋白质羰基含量增高、抗氧化剂GSH含量降低，说明肢体挫压伤能引起肝组织抗氧化能力降低和氧化损伤，与以往报道［8］一致，说明氧化应激是创伤应激导致远隔器官损伤的重要发病途径。实验给予适量外源性H2S在一定程度上缓解了大鼠后肢挤压引起的MDA、蛋白质羰基生成增多和GSH减少，相反，人为抑制内源性H2S生成加剧了大鼠后肢挤压引起MDA、蛋白质羰基生成增加，提示外源性H2S可能通过调节氧化应激而减轻创伤应激引起的急性肝损伤，肢体挫压伤很可能通过引起内源性H2S生成减少、削弱了机体抗氧化效应而导致急性肝损害。Kimura等［17］报道H2S能上调GSH代谢酶表达、增加GSH生成来保护神经元免受氧化损伤。新近发现H2S预适应或后适应均能诱导转录因子Nrf2核移位、上调血红素加氧酶－1，从而减轻了脂多糖引起的大鼠肝细胞内质网应激及肝细胞凋亡［18］。本实验结果显示，大鼠后肢挫压伤导致肝组织CSE mRNA表达下调，这可能是CSE活性降低、H2S生成减少的原因。然而，肢体挫压伤引起CSE mRNA表达下调的原因和分子机制尚不清楚，有待进一步研究。值得提出的是，给予外源性H2S后能完全逆转大鼠后肢挤压引起的CSE mRNA表达下调，表明外源性H2S对肝内源性H2S生成酶CSE具有正反馈诱导调节作用。

综上所述，本实验主要新发现是内源性H2S通过调节氧化应激参与了创伤应激引起的急性肝损伤，为进一步研究T-MODS急性肝损伤发生的分子机制提供启示性线索，并揭示调控内源性H2S生成可能成为防治急性肝损伤的途径之一。

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（本文编辑：刘宁国）

The Role of Hydrogen Sulfide in Acute Liver Injury Induced by Traumatic Stress in Rats

CEN Xin－hai1，2，ZHANG Zhi－xiang2，WANG Tao1，WANG Yan－sha1，JI Ying－lei1，2，YAN Jun1，2，GU Zhenyong1，2
（1.Department of Forensic Medicine，Medical College of Nantong University，Nantong 226001，China；2.Medical College of Soochow University，Suzhou 215123，China）

Abstract：Objective To explore the role of hydrogen sulfide（H2S）in acute liver injury induced by crushing hind limbs of rats.M ethods The rats were random ly divided into the follow ing groups:control，crushing，H2S donor sodium hydrosulfide（NaHS）+crushing，H2S inhibitor propargylglycine（PAG）+crushing group.The acute liver injury model was established by crushing the hind limbs of rats w ith standard weight.Rats were sacrificed at 30m in and 120m in after the crush.The activities of serum aspartate aminotransferase（AST）and alanine aminotransferase（ALT）were measured by colorimetric method，and the content of H2S in plasma and the contents of malondialdehyde（MDA），protein carbonyl，glutathione （GSH）in the liver and the activity of H2S generating enzyme（cystathionineγ－lyase，CSE）were determ ined by chemical method.The expression of CSE mRNA in liver was detected by RT－PCR.Results For crush injury group，the levels of AST and ALT in serum，MDA and protein carbonyl in liver increased.The levels of GSH，CSE，CSE mRNA in liver and H2S in serum decreased.The adm inistration of NaHS before limbs crush could attenuate the changes of liver injury，but the pre－treatment w ith PAG could exacerbate the changes.Conclusion The decrease of H2S production could involve in mediating the acute liver injury induced by traumatic stress in rats.

Key words：forensic pathology；wounds and injuries；liver；stress；hydrogen sulfide；rats

收稿日期：（2015-05-12）

通信作者：谷振勇，男，博士，教授，博士研究生导师，主要从事T－MODS、血管生物学和呼吸病理生理分子机制的研究；E－mail：zygusz＠126.com

作者简介：岑新海（1975—），男，博士研究生，主要从事TMODS机制研究

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81273341）；江苏省高校优势学科建设工程项目（PAPD）

文章编号：1004－5619（2016）02－0081－05

中图分类号：DF795.1

文献标志码：A

doi：10.3969/j.issn.1004－5619.2016.02.001