俞哲 刘军权 李佳佳 王琛 王飞 李晓鸥 骆欣

[摘要] 目的 探讨多种自体免疫细胞与恩替卡韦联合治疗慢性乙型活动性肝炎的抗病毒疗效。 方法 将2015年4～9月我院收治的慢性活动性乙型病毒性肝炎患者26例分为两组（对照组和联合治疗组），两组均予以抗病毒治疗，其中联合治疗组12例接受多细胞免疫疗法联合恩替卡韦治疗，对照组14例单用恩替卡韦治疗。并分离单核细胞，体外培养γδ T细胞、NK细胞、NKT细胞，治疗8～12周后评价其疗效。 结果 治疗前两组患者在ALT、HBsAg、HBeAg、HBV DNA比较无统计学差异，联合治疗组HBsAg下降速率（治疗前/治疗后）与对照组比较有统计学差异（4.15±0.86 vs 1.80±0.15，t=2.09，P<0.05）；ALT、HBV DNA在治疗前后，联合治疗组下降幅度大于对照组，但差异无统计学意义（P>0.05）；而HBeAg两组对比无显著性差异。联合组不良反应轻微。 结论 自体多免疫细胞疗法联合恩替卡韦可促进HBsAg清除，对HBV的清除可能有帮助。

[关键词] 自体免疫细胞；NK细胞；NKT细胞； γδT细胞；恩替卡韦；慢性乙型病毒性肝炎

[中图分类号] R575.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）06-0022-04

Study on the short-term efficacy of autologous immune cell therapy combined with entecavir in the treatment of chronic hepatitis B

YU Zhe LIU Junquan LI Jiajia WANG Chen WANG Fei LI Xiaoou LUO Xin

Department of Liver Disease of the Hangzhou Xixi Hospital， Hangzhou Sixth People's Hospital， Hangzhou 310023，China

[Abstract] Objective To evaluate the efficacy of treatment for hepatitis B virus combined entecavir with a variety of autoimmune cells. Methods 26 hospital patients with chronic hepatitis B were divided into two groups（control group and combination treatment group） voluntarily during the period from April to September in 2015. All patients were in accordance with the indications for anti viral treatment. The combination treatment group included 12 patients received treatment combined entecavir with a variety of autoimmune cells and the control group involved 14 patiens accepted treatment of entecavir alone. Mononuclear cells were isolated， γδ T cells， NK cells， NKT cells were cultured in vitro. The efficacy of the two groups were evaluated after 8-12 weeks. Results There were no statistically significant differences in ALT， HBsAg， HBeAg， HBV DNA between the two groups before treatment. There were significant differences in the decrease rate of HBsAg（before/after treatment） between the two groups（4.15±0.86 vs 1.80±0.15，t=2.09，P<0.05）； The efficacy of treatment group was greater than the control group in ALT， HBV DNA， but there was no statistically significant difference（P>0.05）. There was no significant difference between the two groups in the inhibition of HBeAg. Adverse reactions in the treatment group were mild. Conclusion Multicellular autologous immunotherapy combined with entecavir could promote removal of HBsAg. Multicellular autologous immunotherapy may be helpful to the removal of HBV.

[Key words] Autologous immune cells； NK cell； NKT cell； γδT cell； Entecavir； Chronic hepatitis B

多免疫细胞疗法是一群具有较强免疫活性的细胞联合治疗相应疾病的简称，主要包括病毒特异性CTL、NK细胞、γδT细胞、NKT细胞等多种细胞。其中NK细胞与NKT细胞是肝脏固有免疫应答反应中的主要淋巴细胞，这两种细胞约占肝脏淋巴细胞的50%。当HBV急性感染时，肝脏内的NKT能直接激活细胞防御基因家族，诱导β干扰素的分泌，直接抑制病毒DNA复制[1-4]。γδT细胞介于固有和适应性免疫的T细胞，是免疫防御的第一防线，具有免疫调节、参与多种细菌与病毒的免疫应答等作用[5]。提高机体的T淋巴细胞和抗原提呈细胞的细胞免疫功能及增加协同细胞因子等多种方法联合对于清除病毒、打破免疫耐受将起到重要的作用[6]。恩替卡韦（entecavir，ETV）是目前最常用的核苷酸类抗病毒药物，由于具有抗病毒效果迅速、耐药率低等特点而广泛应用于临床[7]。但核苷类似物只能抑制HBV DNA复制，并不能彻底清除乙肝病毒[8]，致使患者需要多年服用抗病毒药物。多种免疫细胞，对于提高患者固有免疫和针对HBV的特异性免疫功能有帮助，与恩替卡韦联合应用，有可能促进HBV的清除。本研究收集自体多免疫细胞联合恩替卡韦治疗慢性乙型活动性肝炎患者资料，与单用恩替卡韦治疗为对照，初步分析疗效、不良反应等临床资料，现将前期研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2015年4～9月我院收治的慢性活动性乙型病毒性肝炎患者26例，符合“2012年中华医学会肝病学分会、感染病学分会制定的《乙型肝炎防治指南》”中的诊断标准和抗病毒治疗适应证，排除非活动性HBsAg携带者/慢性HBV携带者、合并其他肝损疾患（其他嗜肝病毒重叠感染、药物性、酒精性、自身免疫性、代谢性等）、失代偿期肝硬化、肝功能衰竭、活动性出血、重要脏器功能障碍、出凝血功能障碍、妊娠、正在使用免疫抑制药物，或器官移植后长期使用免疫抑制剂等患者。经知情告知，患者自主选择，分为恩替卡韦、自体多免疫细胞联合治疗组12例，男10例，女2例，年龄（37.41±7.54）岁；单用恩替卡韦对照组（ETV组）14例，男12例，女2例，年龄（35.36±8.26）岁。两组患者在性别、年龄方面比较，无统计学差异，见表1。

表1 两组患者一般资料比较

1.2 方法

1.2.1 治疗方法 两组患者均符合抗病毒治疗适应证，经知情告知，患者均选择恩替卡韦分散片（正大天晴药业有限公司，0.5 mg/片：国药准字H20100019）0.5 mg口服，1次/d，抗病毒治疗。

1.2.2 观察指标 两组患者在抗病毒治疗前1～3 d晨起空腹采血检测血常规、生化、乙肝三系、HBV DNA等指标，联合治疗组患者同时机采外周血150 mL进行分离、定向培养。治疗后8～12周对两组患者上述指标进行复检。

1.2.3 自体多免疫细胞分离、培养、回输操作方法

1.2.3.1 单核细胞的分离 机采患者外周血150 mL，转入50 mL离心管，离心2000 rpm，10 min，吸取血浆等分为6份，冻存于-80℃冰箱，供回输细胞时使用；预先将淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque1077，加入50 mL无菌离心管，20 mL/管（分离单个核细胞）；吸取生理盐水将吸取血浆后的标本还原至原始体积，混匀，缓慢加在Ficoll-Hypaque1077上，体积比为1∶1～1.5。600 rpm，室温离心20 min（注意调整离心机加速和减速过程为最低）；用平口巴氏滴管轻轻插入到单个核细胞层，沿着管壁吸取该层，每管加生理盐水至50 mL，轻轻吹匀细胞，离心洗涤3次，除去血小板和分离介质。弃去上清，用无血清1640培养液重悬计数；将分离得到的单核细胞进行分成3份，分别用作γδT细胞、NK细胞、NKT细胞的培养。

1.2.3.2 γδT细胞的培养 取1.2.3.1步骤获得的PBMC细胞一份，以细胞浓度1×106/mL加入适量细胞培养基，并加入预刺激因子：A1、自体血浆10%；在培养的第2天加入A2和A3，第3天再加入A4，3 d以后视培养情况补液或传代，第13天收集细胞，生理盐水洗涤3次，用含有10%患者自身血浆的生理盐水重悬浮，总体积为200 mL，静脉回输患者，第1天回输共2次。

1.2.3.3 NK细胞的培养 取1.2.3.1步骤获得的PBMC细胞一份，以细胞浓度1×106/mL加入适量细胞培养基，并加入预刺激因子：E1、自体血浆10%；在培养的第2天加入E2，第3天再加入E3、E4、E5，3 d以后视培养情况补液或传代，第14天收集细胞，生理盐水洗涤3次，用含有10%患者自身血浆的生理盐水重悬浮，总体积为200 mL，静脉回输患者，第2天回输共2次。

1.2.3.4 NKT细胞的培养 取步骤1.2.3.1 PBMC细胞一份，以细胞浓度1×106/mL加入适量细胞培养基，并加入预刺激因子：B1、自体血浆10%；在培养的第2天加入B2，第3天再加入B3、B4，3 d以后视培养情况补液或传代，第15天收集细胞，生理盐水洗涤3次，用含有10%患者自身血浆的生理盐水重悬浮，总体积为200 mL，静脉回输患者，第3天回输共2次。

1.2.3.5 细胞的质量控制 细胞培养至第7天，取样进行细菌学培养；每次回输前1 h通过凝胶法进行细菌内毒素检查。细胞2℃～6℃冷链运输，2 h内回输患者体内，并记录每次输注细胞后有无寒战、发热及过敏等症状。

1.2.3.6 细胞回输过程中的护理 制备好的细胞悬液灌装于生理盐水中，体积为100 mL，用一次性输血器静脉滴注，速度40滴/min，为避免细胞堵塞输血器管腔或黏附管壁，输注完毕后用20 mL生理盐水冲洗输液瓶和管道。在细胞输注过程中，由专职护士全程负责，严格遵守无菌技术操作原则，如有不良反应，及时汇报医生处理。

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0统计学软件进行处理，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两样本比较采用t检验；偏态分布计量资料以中位数（25分位数，75分位数）M（P25，P75）表示，两样本比较采用非参数秩和检验；计数资料比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组治疗前情况比较

治疗前两组患者在ALT、HBsAg、HBeAg、HBV DNA比较无统计学差异。见表2。

2.2 两组治疗后情况比较

联合治疗组HBsAg下降速率（治疗前/治疗后）与对照组比较有统计学差异，提示自体多免疫细胞疗法联合恩替卡韦对HBsAg抑制程度显著高于单用恩替卡韦组（4.15±0.86 vs 1.80±0.15，t=2.09，P<0.05）；ALT、HBV DNA在治疗前后，联合治疗组下降幅度大于对照组，但无统计学意义；而HBeAg两组对比无统计学差异。见表3。

2.3 不良反应

本研究过程中，每次回输后密切临床观察半小时以上，12例患者仅有1例患者在细胞回输时轻微发热，经密切观察，未予特殊处理，2～4 h内体温恢复正常，其余患者无明显不良反应。

3 讨论

研究表明慢性乙肝的整个病程进展与HBV持续感染所导致的机体免疫功能障碍有着较紧密的关系[9]。其他大多数患者通常采用核苷类似物或/和IFN-α抗病毒治疗，虽然具有一定的临床疗效，但均难以彻底清除病毒[6]。同时有研究发现，部分拥有健全的免疫功能感染者可以依靠较强的免疫力将病毒清除而获得痊愈[10]。肝脏中NK、NKT及γδT细胞等非特异性免疫细胞含量丰富，可占全部肝脏淋巴细胞的2/3，在抗HBV感染免疫中起到了很重要的作用[2-4]，有研究表明[11]乙肝患者外周血来源的γδT细胞存在某些免疫功能的降低，其可能是乙肝慢性化的重要因素。而其他研究表明经诱导培养的γδT细胞可高分泌IFN-γ和GM-CSF等细胞因子，并经过经过二次分布，聚集于肝脏组织内，通过IFN的旁分泌对整合于肝细胞中的HBV DNA进行直接抑制和清除对于提高机体病毒清除率，同时建立肝脏局部的免疫平衡有着重要的意义[12，13]。而NK和NKT细胞作为肝脏固有免疫应答反应中的主要淋巴细胞，在感染HBV时，能诱导干扰素β的分泌，直接抑制病毒DNA的复制[15]，更有研究表明γδT 细胞可能直接参与了HBV急性感染与清除的过程[16]。康海燕等[17]利用DC-CIK联合干扰素治疗慢性乙型肝炎时，联合治疗组肝功能改善、HBV DNA下降明显优于干扰素治疗组，应用免疫细胞和核苷酸类似物联合抗病毒治疗可打破免疫耐受，维持机体的免疫平衡，将利于HBV DNA的清除。本研究中，联合治疗组ALT、HBV DNA下降幅度略大于单行恩替卡韦治疗结果，虽无明显差异（P>0.05），但也提示多细胞治疗有可能在辅助降低HBV病毒量及改善肝功能上有重要作用。

本研究中发现恩替卡韦在联合多细胞治疗结果发现，联合组的HBsAg下降幅度明显优于单恩替卡韦组。HBsAg是HBV的外膜蛋白，通过HBV表面基因转录和翻译形成，在病毒感染肝细胞过程中其重要作用，HBsAg与肝内cccDNA密切相关，HBsAg定量检测能较好的反应HBV的复制状态，对接受核苷类抗病毒治疗HBV DNA阴转后的进一步疗效观察具有重要的临床意义[18]。黄跃雁等[19]研究认为，HBsAg的初始水平和中间下降水平均可作为干扰素治疗HBeAg阳性慢性乙肝的早期预测标志，若HBsAg下降较快预示有较好的预后，反之则需要延长治疗时间或联合其他药物治疗。HBsAg下降幅度越大，HBeAg抗原的血清学转换发生率就越高。上述研究均说明了抗病毒治疗期间，HBsAg下降幅度与预后有较大的联系，提示多细胞联合恩替卡韦有可能在缩短抗病毒治疗时间，提高预后效果上有重要意义。

在安全性方面，除在回输过程中出现1例一过性发热外，未出现其他明显不良反应[20]。本研究初步显示了多细胞联合核苷酸类似物在治疗乙型肝炎上的可行性和有效性，但由于研究随访时间短，患者样本量较少，仍需要进一步开展大样本研究加以验证。

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（收稿日期：2015-12-22）