彭新国 安佳佳 董艳 王健 韩晓蓓

[摘要] 目的 探讨脐血与成人外周血中淋巴细胞分泌细胞因子能力的关系。方法 2011年6月—2014年6月，从该院选取60例健康产妇志愿者和召集60例正常志愿者，分为观察组和对照组作为临床研究对象。取60例健康产妇志愿者分娩后的脐带血进行研究，同时对60例正常志愿者的外周血进行研究，将两组志愿者的淋巴细胞分泌细胞因子能力进行对比，并分析讨论。结果 观察组和对照组志愿者在经过淋巴细胞分泌细胞因子能力的观察后，其中观察组淋巴细胞分泌细胞因子能力低于对照组（如脐血和成人外周血 IFN-γ、 TNF-α、TNF-α、 IL-2、IL-4的t值分别为 46.738 2、 65.267 7、 54.904 3、18.404 6，P<0.05）。结论 脐血与成人外周血中淋巴细胞分泌细胞因子能力相比较，在一定范围内充质干细胞和淋巴细胞分泌细胞因子能力有关，对植物血凝素诱导的淋巴细胞增殖具有抑制作用。

[关键词] 淋巴细胞；细胞因子；流式细胞术

[中图分类号] R392.3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2016）03（c）-0048-03

Analysis of Umbilical Cord Blood and Adult Peripheral Blood Lymphocyte Cytokine Secretion Ability

PENG Xin-guo， AN Jia-jia， DONG Yan， WANG Jian， HAN Xiao-bei

Affiliated Hospital of Binzhou Medical College， Binzhou， Shandong Province， 256603 China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between umbilical cord blood and adult peripheral blood lymphocyte cytokine secretion ability. Methods 60 cases of healthy pregnant volunteers and 60 cases of normal volunteers treated in our hospital from June 2011 to June 2014 were selected and divided into the observation group and the control group， the umbilical cord blood of 60 cases of healthy pregnant volunteers and peripheral blood of 60 cases of normal volunteers were taken for research， the cytokine secretory capacities of lymphocytes of the two groups were compared， analyzed and discussed. Results The observation showed the cytokine secretory capacity of lymphocytes in the observation group was lower than that in the control group， the differences in the IFN-γ， TNF-α， TNF-α， IL-2 and IL-4 between umbilical cord blood and adult peripheral blood were statistically significant （t=46.738 2， 65.267 7， 54.904 3， 18.404 6， P<0.05）. Conclusion The comparison in cytokine secretory capacity of lymphocytes between umbilical cord blood and adult peripheral blood shows that the cytokine secretory capacity of mesenchymal stem cell is positively correlated with that of lymphocytes within a certain range， and it plays an inhibition role in lymphopoiesis induced by phytoagglutinin.

[Key words] Lymphocytes； Cytokine； Flow cytometry

脐带血含有造血干细胞且易于采集[1]，又因其免疫原性弱等优点，宜于临床疾病治疗，由此脐带血间的充质干细胞作为造血新种子细胞逐渐受到人们的关注[2]。国内外研究认为，骨髓间的充质干细胞可对混合淋巴细胞反应和丝裂原刺激的T细胞增殖过程进行抑制，通过转化生长因子自分泌发挥转化生长因子的免疫调节作用[3-5]。脐带血其间的充质干细胞对淋巴细胞的作用及影响在目前临床研究中尚未完全清楚，因此，该文作者对脐带血其间的充质干细胞对淋巴细胞的作用及影响进行相关研究，在2011年6月—2014年6月中在该院选取60例健康产妇志愿者和召集60例正常志愿者作为临床研究对象，观察患者淋巴细胞分泌细胞因子的表达，对脐带血与淋巴细胞分泌细胞因子的能力相关性进行研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

从该院选取60例健康产妇志愿者和召集60例正常志愿者，分为观察组和对照组作为临床研究对象。其中观察组60例女性年龄为20～60岁，平均年龄为（40.11±5.42）岁，平均体质量为（56.82±9.56）kg，平均身高为（164.45±8.15）cm；对照组60例女性年龄为25～64岁，平均年龄为（40.77±6.77）岁，患者平均体质量为（58.22±7.57）kg，平均身高为（163.77±4.77）cm。以上患者排除肿瘤患者和血液疾病等患者，健康状况均为稳定。在该研究实验进行之前，以上所有参与实验志愿者均对该次实验有足够了解，均属自愿，签署自愿协议文件，在研究过程中志愿者可随时退出，整个实验过程贯彻伦理学原则。

1.2 方法

60例健康产妇志愿者和60例正常志愿者分别为观察组和对照组。观察组：将志愿者脐血中的单个核细胞分离后进行培养：在无菌操作下采集志愿者脐血，使用肝素抗凝，分离出单个核细胞，使用10%含小牛血清和1×10-3 mol/L氢化可的松的IMDM培养液，而后将脐血单个核细胞放置培养瓶中，规格为1×109/L。在二氧化碳培养箱中培养7 d后，将液体换取，去除悬浮状的细胞，3～4 d换液1次。7 d后使用2.5 g/L的胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA混合液消化传代培养，使用第三代细胞进行实验。对照组：使用含10%的小牛血清、10 mg/L植物血凝素的IMDM培养液将正常志愿者的外周血单个核细胞放置培养箱中，3 d后收集细胞进行实验，规格为1×109/L。观察两组淋巴细胞分泌细胞因子的表达。参照Cytofix/CytoPerm Plus试剂盒说明书和该实验室经验进行细胞的固定、穿孔和流式细胞术（细胞因子的检测）。

1.3 观察指标

观察两组淋巴细胞分泌细胞因子（INF-γ、TNF-α、IL-2、IL-4）能力的作用。

1.4 统计方法

在实验结束后，该文研究项目将实验所有数据准确录入到SPSS 19.0软件中进行处理，以95%作为可信区间。计量资料使用均数±标准差（x±s）表示，进行t检验。

2 结果

将脐血、外周血中淋巴细胞在体外经刺激培养后产生细胞因子（INF-γ、TNF-α、IL-2、IL-4）的百分含量，两两对应相比，经统计学处理，差异有统计学意义（P<0.001）。见表1。

3 讨论

GVHD的发生可能性和其严重程度，在造血干细胞移植中与细胞因子分泌失调有密切的联系[3]。细胞因子在GVHD损伤靶组织中占有重要地位[4]。该研究结果显示成人外周血中淋巴细胞在体外经刺激培养后产生细胞因子的百分含量明显高于脐血，数据间比较差异有统计学意义（P<0.001）。

该课题与以往研究淋巴细胞分泌细胞因子能力相关的课题相比，其创新性主要体现在运用易采集的脐血进行研究，进一步探讨了人脐血、成人外周血中淋巴细胞在体外活化后胞内细胞因子的变化，作者认为脐血造血干细胞移植后是急、慢性GVHD发生低下的又一可能机制[5]。CD4+淋巴细胞按其所产生细胞因子的种类不同，可分为Th1细胞和Th2细胞。IFN-γ、TNF-α、IL-2主要由Th1细胞分泌，主要介导细胞免疫应答，是引发GVHD的主要细胞因子。IFN-γ具有抑制病毒复制、调节免疫功能、抑制肿瘤细胞生长、调节NK细胞的抗瘤活性等多种生物学功能[6]；TNF-α具有抗肿瘤、参与免疫应答等极为广泛的生物学活性；IL-2可促使B淋巴细胞、NK细胞增殖，活化体内杀伤细胞，具有很强的抗肿瘤和抗病毒作用，并参与移植排斥反应，还可以促使NK细胞产生干扰素，促进这些杀伤细胞杀伤肿瘤细胞和清除被病毒感染的细胞，以上3种细胞因子均可促进或增强GVHD效应。在我国相关专家学者彭新国，宿振国，纪冰等对脐血与成人外周血中T、B淋巴细胞分化抗原的相关分析中，他们认为“脐血和成人外周血中的T、B零八细胞的含量存在一定程度上存在差异”，而这种差异主要和GVHD和发生率低、强度弱以及GVL效应好有很大关系，在其研究中，脐血与成人外周血CD3+的比较中，脐血含量为（56.758±8.03），而成人外周血含量为（68.70±.5.95），差异有统计学意义（P<0.01）。除了CD4+/CD8+与CD3+CD19+以外，CD3+CD4+、CD3+CD8+都与血CD3+的比较相似[7]。在他们的研究中，与该研究类似之处在于同是脐血与成人外周血中细胞因子分泌能力，但不同之处在于其从CD4+/CD8+、CD3+CD19+、CD3+CD4+、CD3+CD8+等细胞分化抗原方面入手，而该研究项目从IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4的水平表现进行分析。

该研究表明，脐血淋巴细胞产生IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4的水平均明显低于成人外周血。据研究结果，可以推测出这主要与脐血中淋巴细胞亚群的分布特点（以相对幼稚的CD45RA+淋巴细胞为主）及其分泌细胞因子的功能尚未完全成熟相关。进一步说明了脐血相对成人外周血中淋巴细胞的幼稚性和分泌细胞因子能力的低下。设想合理联用细胞因子（IL-4）或应用细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-2等）拮抗剂在GVHD级链反应发生前就阻断其致病细胞因子的异常调节作用，可能是预防GVHD的发生或降低其强度、增强GVL效应的途径之一[8]。

综上所述，研究成人外周血、脐血淋巴细胞活化后胞内细胞因子的分泌特性，对阐明GVHD和GVL的可能机制有所帮助，该研究结果显示成人外周血中淋巴细胞表达细胞因子较为活跃，说明脐血中淋巴细胞的幼稚性和分泌细胞因子能力的低下，因此该文作者建议在临床分析明GVHD和GVL的可能机制时，可收集成人外周血进行相关研究，以得到为精确的研究结果。

[参考文献]

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[2] Fernandez MN， Regidor C， Cabrera R， et al. Cord blood transplants： early recovery of neutrophils from co-transplanted sibling haploidentical progenitor cells and lack of engraftment of cultured cord blood cells， as ascertained by analysis of DNA polymorphisms[J]. Bone Marrow Transplant，2001，28：355-363.

[3] Wu KH，Tsai C，Wu HP，et al.Human application of ex vivo expanded umbilical cord-derived nesenchymal stem cells：humatopoiesis after cord blood transplantation[J].Cell Transplant，2013，22（11）：2041-2051.

[4] Iafolla MA， Tay J， Allan DS.Transplantation of Umbilical Cord Blood-Derived Cells for Novel Indications in Regenerative Therapy or Immune Modulation： A Scoping Review of Clinical Studies[J].Biol Blood Marrow Transplant，2013，9（22）：1083-8791.

[5] Berglund S，Gertow J，Magalhaes I，et al. Cord blood T cells cultured with IL-7 in addition to IL-2 exhibit a higher degree of polyfunctionality and superior proliferation potential[J]. J Immunother，2013，36（8）：432-437.

[6] 彭新国，王健，刘永云，等.脐血与成人外周血中淋巴细胞分化抗原含量的比较[J].中国实用医刊，2013，40（2）：7-9.

[7] 彭新国，宿振国，纪冰，等.脐血与成人外周血中T、B淋巴细胞分化抗原的相关分析[J].国际检验医学杂志，2010，31（2）：150-152.

[8] 徐志娟，盛立霞，欧阳桂芳，等.脐带血间充质干细胞对外周血T淋巴细胞亚群的影响[J].中国实验血液学杂志，2015，23（1）：207-211.