张　昊，崔岱宗，张　淼，赵　敏（东北林业大学微生物实验室，黑龙江哈尔滨　150040）



固定化技术在偶氮染料废水处理中的应用技术

张昊，崔岱宗，张淼，*赵敏
（东北林业大学微生物实验室，黑龙江哈尔滨150040）

摘要：研究利用固定化包埋的方法，将1株偶氮染料降解菌固定于聚乙烯醇（PVA）颗粒内部，并测定其在好氧条件下对染料的降解特性。研究表明，聚乙烯醇（PVA）在包埋过程中相对其他2种载体（明胶和海藻酸钠）有球型好、硬度大、不易黏连、耐受高温等优点。染料降解试验表明，该固定化颗粒在反应体系温度为40℃，pH值为5～6的环境中有最佳降解速率。包埋后的细菌相对于游离细菌可以连续使用更多的次数，在保持球型完整的情况下可连续使用8次以上，在实际应用中具有重要的意义。

关键词：固定化；聚乙烯醇；偶氮染料；微生物降解

目前，染料废水的排放量占工业废水排放总量的10%，并且随着现代染料与印染工业规模的扩大，染料废水的排放量还在不断升高。在全球范围内，每年都有15%的染料废物被排放到环境中，对全球范围内的生态环境造成了极大的威胁[1]。染料废水的颜色浓度高、化学组成复杂，且其所含的有机物大多是具有致癌、致畸、致突变能力的物质[2-3]。若不经过处理直接排放，会给生态环境带来严重威胁，对人类健康和农业生产发展产生严重影响。偶氮染料生产成本低、生产工艺成熟、色光良好且不易褪色，因而广泛应用于纺织品及皮革制品的染色工艺中[4]。其化学性质比较稳定，成分比较复杂，是公认处理难度较高的有机废水[5]。

利用微生物在繁殖过程中的生长代谢来分解废水中有机物的方法叫做生物法。微生物有体积小、表面积大、繁殖速度快的优势，且微生物细胞内的降解酶具有专一性和高效性，对环境的抗逆性强[6]。因此，生物法是目前最为环保的染料降解方法，有着广阔的应用前景。

固定化技术主要包括载体结合法、交联法和包埋法，其中包埋法是固定化技术中较为理想的方法[7]。利用高分子聚合物在聚合的过程中会形成类似于孔隙的间隔，将相对较小的微生物细胞包埋在孔隙中，从而达到细胞固定的目的。该方法操作简单，可以将微生物固定在聚合物所形成的特殊空间当中，且这种结构较为紧密，可以防止细胞在空间中流动渗漏[8]。然而，分子质量相对较小的染料底物和细胞产物则可以在孔隙中自由流动，对细胞毒害作用较小，固定化强度较高、稳定性较好。

本试验利用1株偶氮染料降解菌H10，通过细胞培养和微生物固定化技术将其包埋，再通过染料降解试验探索和优化细菌固定化的条件，以及固定化颗粒对偶氮染料的降解效果和其在降解体系中的连续使用能力，为实际应用打下基础。

1　试验材料与方法

1.1验材料

本试验所使用的菌株H10分离于辽宁海城某印染厂附近长期受偶氮染料污染的土壤中。经研究表明，H10菌株可在有氧条件下，对偶氮类染料进行高效降解。海藻酸钠、甲基红、聚乙烯醇（PVA）、明胶、碳酸氢钠、胰蛋白胨、硼酸、戊二醛、氯化钙、液体石蜡、氯化钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、酵母提取物等均为国产分析纯，购于天津光复精细化工有限公司。

1.2验方法

1.2.1 PVA固定化颗粒的制备

将1.5%海藻酸钠与10%的PVA混合，微波炉加热使其完全溶解，冷却后加入OD600为1.2的菌悬液混合均匀，用20 mL注射器将其滴入饱和硼酸溶液中交联2 h，再转移至1 mol/L的Na2PO4溶液中继续交联2 h，得到白色有弹性的固定化颗粒，然后用生理盐水清洗2次后可长时间保存在冰箱中备用。

1.2.2海藻酸钠固定化颗粒的制备

取2%的海藻酸钠加热溶解，冷却后加入OD600为1.2的菌悬液，用玻璃棒搅动液体使细菌充分散开，用20 mL注射器将溶液逐滴加入2% CaCl2溶液中进行交联，8 h后过滤取出，用生理盐水洗净备用。

1.2.3明胶固定化颗粒的制备

将12%的明胶溶液加热溶解，冷却至室温后加入OD600为1.2的菌悬液混合均匀，将液体石蜡置于冰浴中，再将明胶溶液用注射器滴入液体石蜡中形成小球，待小球成型后过滤将其置于0.5%戊二醛中交联2 h。

1.2.4不同固定化载体对偶氮染料降解效率的对比

取100 mL三角瓶，装入50 mL的LB培养基后进行高压蒸汽灭菌，冷却后向瓶中加入2.5 mL配制好的甲基红染液，使体系中的染料质量浓度为100 mg/L；再取海藻酸钠、PVA、明胶固定化颗粒分别加入降解体系中。将以上降解体系置于37℃恒温培养箱中震荡培养，每2 h测定吸光度，绘制降解曲线。

1.2.5固定化颗粒的连续使用能力测定

向50 mL的LB培养基中加入2.5 mL甲基红染液使体系中染料质量浓度为100 mg/L，再加入制作好的PVA固定化小球。另做对照组，向LB培养基中加入2.5 mL染料，并加入OD600为1.2的等量游离菌液。将降解体系置于37℃恒温培养箱中，测定染料完全降解后的吸光度和所需的降解时间。待降解反应进行完全后，测定游离菌试验组中的吸光度，并将OD600值调至1.2，再加入等体积的染料进行第2次反应；试验组中则直接过滤出固定化颗粒加入新的降解体系中进行反应。连续该步骤直至降解反应无法继续进行，比较固定化颗粒和游离菌的连续使用能力。

1.2.6固定化颗粒在pH值梯度条件下的降解能力对比

配制NaOH和HCl母液，备用。将LB培养基高压灭菌，加入等量染料溶液使反应体系染料终质量浓度为100 mg/L，同时加入等量固定化颗粒。用pH计调整反应体系酸碱度，使其分别为2，12。将以上反应体系置于37℃恒温培养箱中震荡培养，每6 h测定吸光度，检验染料降解效果。

1.2.7固定化颗粒在不同温度条件下的降解能力对比

将LB培养基进行高温灭菌处理，加入等量的固定化颗粒以及终质量浓度为100 mg/L的甲基红染料。分别将以上降解体系置于恒温培养箱中，并设定降解温度别为10，20，30，40，50℃进行振荡培养，测定各体系中的降解率。

2　结果与分析

2.1同固定化载体对偶氮染料降解效率的对比结果

由于不同固定化载体之间的材质不同，所形成的固定化孔隙不同，对细菌的包埋能力和强度不同，且染料溶液在其内部的扩散性能不同，因而造成了使用不同包埋剂制成的固定化颗粒对染料降解速率的不同。

不同固定化载体对偶氮染料降解效率的对比见图1。

图1　不同固定化载体对偶氮染料降解效率的对比

由图1可见，以游离细菌作为对照，各试验组的降解率差别很大。其中，游离细菌试验组仅经过6 h染料降解率就可达到88%以上，降解体系中无肉眼可见的红色。其他试验组中以PVA组的降解效果最为显著，几乎达到了与对照组相同的速度，说明PVA对细菌能起到很好的包埋效果，对微生物的毒害作用小，且对介质的通透性良好。海藻酸钠组的降解效果次于PVA组，8 h后的降解率也达到87%以上。作为一种天然提取物包埋剂，其固定化效果很好，球型完整均匀且无黏连现象，适于用作固定化的载体，可在固定方法上加以优化，以提高其降解速率。明胶组的染料降解试验结果不理想，8 h后降解率仍未达到50%，且其固定化方法较为复杂，需要使用戊二醛等化学试剂，对人体有害。尽管其球型较好，但硬度不够、黏连现象较为严重。某些细菌可以以明胶为食，固定化颗粒后期可能出现破裂现象，总体来看不适宜用作细菌固定化材料。综上，本研究后续进展均采用PVA作为固定化载体。

2.2定化颗粒的连续使用降解能力测定结果

固定化包埋细菌的优势在于其方便回收和可重复利用的性质，因此连续投加试验的结果可以反应其在实际应用中的性能以及相对游离细菌的巨大优势。

游离H10菌的连续使用能力测定结果见表1。

表1　游离H10菌的连续使用能力测定结果

由表1可见，游离细菌仅在第1次的试验中将甲基红降解了83%以上，为了保证试验的准确性，在每次连续投加染料之前都重新调整菌液的OD值，以保证加入的细菌数量一致。而在第2次试验中，游离细菌已经发生了部分退化，6 h后肉眼可见仍有甲基红未被降解，16 h后测定的降解率为78%。第3次降解试验在20 h后降解率为83%，此时容器中的菌液颜色已由初始的乳白色变暗，表示细菌发生了比较严重的退化。第4次连续降解试验将降解时间延长至24 h，降解率仅为46%。

PVA固定化颗粒连续使用降解能力测定见图2。

图2　PVA固定化颗粒连续使用降解能力测定

由图2可见，以PVA作为固定化载体的试验组在连续使用8次以后仍具有较强的降解能力，在降解时间为6 h的条件下降解率始终在80%～90%，且连续使用8次之后固定化颗粒无明显变化，球型完整无破裂。值得注意的是，降解率在前5次连续降低之后，出现轻微回升，考虑是否因为细菌在固定化颗粒内部可以进行增殖，使颗粒内部细菌数量上升导致降解速率的加快。这个观点有待于后续试验的进一步证实。

结果证明，本研究所制成的固定化小球极为耐用。郭建博等人曾研究指出，利用海藻酸钙方法制成的小球在连续使用4次后，其加速降解反应的能力开始减小，并且随着连续使用次数的继续增加，海藻酸钙小球的强度也会开始降低。而本试验中使用PVA方法制成的固定化颗粒在连续使用了8次之后依然具有很强的降解能力，且在此过程中PVA小球的球型一直保持完整，显示出了PVA作为固定化载体相对于游离细菌在连续使用能力上的巨大优势，适于在实际工业生产当中应用。

2.3定化颗粒在pH值梯度条件下的降解能力对比结果

为了检验固定化颗粒在极端pH值条件下的降解能力，本研究测定了pH值梯度对固定化颗粒的影响。

固定化颗粒在pH值梯度条件下的降解能力对比见图3。

图3　固定化颗粒在pH值梯度条件下的降解能力对比

由图3可见，PVA固定化颗粒在pH值为5～9均具有良好的降解效果，都能达到最终66%以上的降解率。其中，在降解体系的pH值为6时的固定化颗粒对染料降解速率最快，6 h的降解率为84.53%；而pH值小于5和pH值大于9的部分均未能对染料进行有效降解，因此未在图3中显示其结果。然而，在pH值2～11时，反应体系中的PVA固定化颗粒均未发生溶解、破裂等现象，因此可知PVA材料有较强的耐酸碱性，适合用于各种pH值条件。图3中降解速率产生差别原因在于，极端pH值条件下细菌产生的酶活性受到影响，进而影响了染料降解。

2.4定化颗粒在不同降解温度条件下的降解能力对比结果

降解温度梯度试验检验了PVA固定化颗粒在不同降解温度中对染料的降解能力，对实际应用具有重要的意义。

固定化颗粒在不同降解温度下对偶氮染料的降解率见图4。

图4　固定化颗粒在不同降解温度下对偶氮染料的降解率

由图4可见，包埋菌的最适降解温度为40℃左右，该条件下6 h的降解率可以达到69.26%；其余降解温度试验组的降解率均在28.91%以下。而当降解时间延长至24 h之后，40℃以下试验组的降解率均有了很大的提高，只有50℃环境试验组没有继续降解。推测细菌所产生的偶氮染料还原酶在高温条件下发生失活，而在6 h以内，固定化颗粒内部处于温度上升期，细菌所产生的酶未达到失活温度之前进行了一部分降解；当降解温度达到50℃以后，酶失活导致染料不再发生降解。

另外，在50℃的试验组中，可以观察到PVA固定化颗粒的体积有了明显增大，小球外表不再呈现乳白色，产生了透明效果；其他降解温度试验组中PVA颗粒没有明显的体积变化。据此推测，高温可能会对固定化载体的材料产生一定影响，不同材料可以耐受的最高温度不同，在实际应用中可以根据不同的降解温度环境选择不同种类的载体材料。

3　结论

本研究利用载体包埋的方法对偶氮染料降解菌株H10进行固定化处理，并对固定化后得到的颗粒进行了一系列试验测定其降解能力，试验结论如下。

在载体选择上使用PVA作为包埋剂得到的固定化颗粒球型好，孔隙大小适宜，可以在固定住细菌的同时使染料分子、酶类及其他生物代谢产物自由通过，可多次连续使用且对微生物无毒害作用。PVA固定化颗粒可以耐受pH值2～11的极端酸碱环境，且当反应体系pH值在5～9时，固定化颗粒中的细菌可对染料进行降解，其中最佳pH值为6；过高或过低的降解温度均会对细菌活性产生影响，进而影响染料降解速率，因此试验测定固定化颗粒在37℃附近有着最佳的降解效果，PVA固定化颗粒在50℃以下的环境中均保持稳定，在50℃时体积开始发生膨胀、颜色变透明、孔隙变大，据此推测PVA作为包埋剂的固定化颗粒不适于在高温下作业。在pH值、降解温度条件均为最优的情况下，PVA固定化颗粒可以在保持球型完整的情况下连续使用8次以上，在实际应用中具有重要的意义。

参考文献：

[1]王侃，陈英旭，叶芬霞.SiO2负载的TiO2光催化剂可见光催化降解染料污染物[J].催化学报，2004，25（12）：931-936.

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[5]薛方亮，张雁秋.染料废水处理技术最新研究进展[J].水科学与工程技术，2007（2）：26-29.

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[8]蒋宇红，黄霞，俞毓馨.几种固定化细胞载体的比较[J].环境科学，1993（2）：11-15.

The Application of Immobilization Method in Degradation of Azo Dye Wastedwater

ZHANG Hao，CUI Daizong，ZHANG Miao，*ZHAO Min
（Department of Microbiology，Northeast Forestry University，Harbin，Heilongjiang 150040，China）

Abstract：In this study，a strain of azo dyes degradation bacteria is immobilized in the PVA granular.The degradation characteristics are investigated by measuring the decolorization rate of azo dyes in aerobic conditions.The results indicate that PVA granular has better performance in shape，stability and dispersity compared with gelatin and sodium alginate granular.The decolorization results indicate that PVA granular can make the best effect of decolorization at 40℃and pH 5～6.Meanwhile，the granular can support more decolorization cycles compare with dissociative bacteria，it can maitain intact spherical continuous use for more than 8 times，which has a significant values in practical industries.

Key words：immobilization；PVA；azo dyes；microbial degradation

中图分类号：TQ613.1

文献标志码：A

doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.02.038

文章编号：1671-9646（2016）02b-0034-04

收稿日期：2015-12-11

作者简介：张昊（1990—），男，硕士，研究方向为环境微生物。

*通讯作者：赵敏（1964—），男，博士，教授，研究方向为环境微生物。