朱琳 徐颖 孔聪 粟海波 黄琪 朱胜玲 王洪海



结核分枝杆菌新型抗原Rv3400的免疫原性研究

朱琳 徐颖 孔聪 粟海波 黄琪 朱胜玲 王洪海

目的 用结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)特异性抗原Rv3400 联合弗氏不完全佐剂(incomplete Freund’s adjuvant，IFA)构建结核亚单位疫苗(Rv3400-IFA)，在 C57BL/6小鼠体内评估其免疫效应。体外用抗原Rv3400感染巨噬细胞RAW264.7并评估其免疫应答。方法 PCR扩增基因Rv3400，构建重组质粒pET28a(+)-Rv3400，转入大肠埃希菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞中，诱导表达并纯化Rv3400蛋白。用抗原Rv3400、阳性对照脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)，分别刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7，阴性对照为未刺激的巨噬细胞，流式细胞术检测细胞表面分子表达，收集细胞培养上清，ELISA 检测细胞因子的分泌。另一方面纯化的Rv3400蛋白与IFA充分乳化构建亚单位疫苗免疫小鼠；C57BL/6小鼠采用数字表法随机分为3组，分别为实验组Rv3400组、阳性对照组Rv3425组、 阴性对照组IFA组，每组5只，每2周1次、共免疫3次。分别采用酶联免疫斑点检测技术(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)和酶联免疫吸附测定(ELISA) 技术对免疫小鼠的细胞免疫和体液免疫进行评估。结果 (1)成功克隆表达并纯化结核分枝杆菌特异性抗原Rv3400。(2)体外细胞实验结果显示：Rv3400抗原刺激巨噬细胞，其表面分子CD80、CD86、CD40、MHCⅡ表达量显著提高，阳性细胞比率[分别由未刺激的(34.70±2.40)%、(31.25±18.31)%、(41.80±6.01)%、(44.30±0.44)%提高至1 μg/ml Rv3400抗原刺激后的(90.45±7.71)%、(90.10±4.10)%、(89.97±7.79)%、(85.13±5.12)%]；能促进细胞分泌高水平的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)，分别达(49 217.0±390.61)pg/ml、(1783.4±51.18) pg/ml。(3)免疫小鼠后，ELISPOT结果显示：实验组Rv3400组小鼠分泌INF-γ的斑点形成细胞(spot forming cells,SFC)(136.20±95.09)显著高于阴性对照组(14.00±9.62)(t=2.859，P<0.01)；ELISA结果显示: Rv3400组小鼠T细胞产生TNF-α和IFN-γ的水平[(247.38±142.268)pg/ml、(325.45±75.19)pg/ml)]明显高于阴性对照组[(69.25±60.06)pg/ml、(2.22±1.28)pg/ml(t=2.579，P<0.05；t=8.597，P<0.01)]；(4)Rv3400 组小鼠脾CD4+CD44high、CD4+CD62Llow、CD8+CD44high、CD8+CD62LlowT淋巴细胞百分比[(44.20±11.95)%，(43.56±11.90)%，(48.88±7.42)%，(47.04±7.72)%]与对照组IFA组[(27.02±6.56)%，(62.60±4.73)%， (30.57±6.00)%，(58.48±6.06)%]相比，差异有统计学意义(one-way ANOVA，F=18.460，F=8.108，F=32.194；F=4.080；P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.05)，呈显著性增加。(5)通过间接ELISA测定免疫后的小鼠血清抗体IgG效价水平高达1∶409 600，表明抗原Rv3400也能诱导有效的体液免疫应答；IgG2b/IgG1水平为1.8，说明抗原Rv3400诱导小鼠以Th1型免疫反应为主。结论 亚单位疫苗Rv3400-IFA 在C57BL/6 小鼠体内可产生较好的细胞免疫和体液免疫效应。结核分枝杆菌特异性抗原Rv3400有望成为新的结核病疫苗设计及诊断的候选抗原。

分枝杆菌，结核； Rv3400； 亚单位疫苗； 细胞免疫； 体液免疫

结核病(TB)是由结核分枝杆菌感染引起的重大传染病，是世界上仅次于艾滋病(AIDS)的第二大高死亡率的传染性疾病。……