李敏　胡金梅　张锦　李秀轻　李玮桓　苑巍

063000　河北省唐山市，华北理工大学附属医院药学部(李敏、胡金梅、张锦、李玮桓、苑巍)；河北医科大学第二医院(李秀轻)



·药物研究·

液质联用分析间尼索地平消旋体大鼠组织分布特征

李敏胡金梅张锦李秀轻李玮桓苑巍

063000河北省唐山市，华北理工大学附属医院药学部(李敏、胡金梅、张锦、李玮桓、苑巍)；河北医科大学第二医院(李秀轻)

【摘要】目的利用液质联用技术研究大鼠体内间尼索地平消旋体的组织分布特征。方法20℃下，利用C18柱，以乙腈-水(70∶30, v/v)为流动相，流速为0.8 ml/min，检测波长237 nm。扫描方式采用多重反应监测,离子化模式采用ESI选择性负离子检测。组织匀浆液采用正己烷-乙醚(1∶1)萃取，进样LC-MS-MS分析。结果大鼠灌胃给予间尼索地平消旋体20 mg/kg后，在大鼠小肠、肺和肝中，30和150 min的分布量均较90 min高，在脑组织中也有一定的分布。结论本法灵敏度高，操作方便，适合于大鼠体内间尼索地平消旋体的组织分布研究，为其临床实验研究与新药申报提供了理论依据。

【关键词】间尼索地平；消旋体；液质联用；药动学

目前，高血压是最常见的慢性病，也是引起心脑血管病最主要的危险因素，高血压可能会导致脑卒中、心肌梗死、心力衰竭及慢性肾脏病等严重并发症，因此，研制与开发防治高血压的药物具有重要的社会意义。间尼索地平(m-Nisoldipine)消旋体作为新型的1，4-二氢吡啶类钙拮抗剂[1,2]，在降压方面效果显著[3-5]。本研究以SD大鼠为研究对象，通过优化色谱质谱条件，采用液-质联用(LC-MS-MS)技术[6-8]对间尼索地平消旋体在大鼠体内的组织分布特征进行全面研究[9-12]。

1仪器与试药

1.1仪器Agilent 1100LC/MSD色谱系统API 4000型液相色谱-三重四级杆质谱联用仪，电喷雾离子化源(ESI源)(美国ABI公司)；液相色谱输液泵：Shimadzu 20A 系统：二元梯度泵、在线脱气机、柱温箱(日本Shimadzu公司)；MDS Sciex Analyst software (美国ABI公司)；LG16-W型离心机(北京医用离心机厂)。

1.2试药间-尼索地平对照品(河北医科大学药学院提供)；甲醇、乙腈均为色谱纯(美国Tedia公司)。 SD大鼠，20只，体重(250±10)g左右，雄性(河北医科大学实验动物中心提供；合格证编号为DK0705-0076号)。实验前禁食12 h，饮水不限。

1.3配制间尼索地平消旋体混悬液和对照品溶液

1.3.1间尼索地平消旋体混悬液：精密称取间尼索地平消旋体约125 mg，加入羧甲基纤维素钠(0.5%)50 ml，振摇5 min使混匀，即得2.5 mg/ml的间尼索地平消旋体混悬药液。

1.3.2对照品溶液：精密称取适量间尼索地平消旋体对照品，置于量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度配制成对照品储备液(20 μg/ml)，-20℃保存备用。

1.4制备和预处理组织样本

1.4.1样品制备：灌胃给予大鼠混悬药液后，于10 min、30 min、90 min和150 min[13,14]处死，并迅速取出大鼠各器官，用0.9%氯化钠溶液冲洗组织，滤纸吸干表面水分，加3倍量0.9%氯化钠溶液制成1∶3的组织匀浆，-20℃冰箱保存。

1.4.2预处理：在避光条件下，将冷冻保存的组织匀浆置于37℃水浴上融化，取1.0 ml匀浆液置试管中，精密加入内标乙腈溶液(20 μg/ml)10 μl，NaOH(5 mol/L)水溶液50 μl，旋涡10 s，用3 ml正己烷-乙醚(1∶1，v/v)提取，旋涡1 min，4 000 r/min离心10 min，取2 ml上清液，氮气吹干，40 μl甲醇溶解，旋涡2 min，10 000 r/min离心10 min，取20 μl作LC-MS-MS分析。同法取空白组织，-20℃冰箱保存。

1.5选择LC-MS-MS条件

1.5.1色谱柱：C18柱(150 mm×4.6 mm；4.6 μm)；温度：20℃；流动相：乙腈-水(70∶30, v/v)；进样量：50 μl；流速：0.8 ml/min，检测波长237 nm。

1.5.2MSD：电喷雾离子化(ESI)源；喷雾电压IS-4 000 V；雾化温度500℃；雾化气NEB(GAS 1)为40 L/min；辅助气AUX(GAS 2)为40 L/min；帘气CUR为20 L/min；碰撞气CAD为8 L/min；碰撞诱导解离(CID)电压为27 V；驻留时间(dwell time)为100 ms；检测方式为负离子多离子反应监测(MRM)，用于定量分析的离子反应为m/z 387.0→m/z122.0(间尼索地平消旋体)。

2方法与结果

2.1专属性间尼索地平消旋体的ESI一级全扫描质谱主要生成准分子离子峰[M-H]-m/z 387.0。选择性对[M-H]-进行二级质谱分析，间尼索地平的主要碎片离子为m/z 122.0，将其作为定量分析时监测的产物离子。测得大鼠空白各组织、空白各组织加样及各组织中间尼索地平消旋体的保留时间为6.11 min，且内源性物质不干扰测定。见图1。

图1　间尼索地平准分子离子峰及其产物离子峰质谱图

2.2标准曲线与定量下限在避光条件下，精密吸取不同体积的间尼索地平消旋体储备液，挥尽溶媒，精密加入大鼠各空白组织匀浆1.0 ml，按“1.4”项下同法操作，制备成40 μl甲醇溶液作为标准溶液，进样20 μl，按上述色谱条件测定，以组织中间尼索地平消旋体峰面积(A)对其浓度进行线性回归，得回归方程。结果表明，组织中间尼索地平消旋体浓度在7～1 500 ng/ml范围内，质谱响应线性关系良好。各组织中间尼索地平消旋体的定量下限均为0.5 ng/ml。见表1。

2.3准确度与精密度取各空白组织匀浆液，按“1.4”项下方法操作，分别制作成20.0、500.0、1 200.0 ng/ml 3种 浓度间尼索地平对照品组织样品各5份，依法测定，结果上述3种浓度下，大鼠各组织中间尼索地平消旋体准确度、日内及日间精密度均≤15%。

表1　间尼索地平消旋体在大鼠各组织样本中的标准曲线及线性

2.4回收率取各空白组织匀浆液，按“1.4”项下方法操作，分别制成20.0、500.0、1 200.0 ng/ml 3种浓度间尼索地平对照品组织样品各5份，测定药物浓度，计算大鼠各组织中3种不同浓度间尼索地平消旋体的回收率均大于80%，其相对偏差均小于15%。

2.5样品稳定性考察取各空白组织匀浆液1.0 ml，按“1.4”项下方法制备20.0、500.0、1 200.0 ng/ml 3种 浓度间尼索地平对照品组织样品各5份，考察其室温放置4 h，样品预处理后室温放置4 h、24 h及经3次冷冻-解冻循环后间尼索地平消旋体的稳定性。结果表明，间尼索地平消旋体组织样品在上述条件下均稳定，相对误差均在±15%，符合生物样品分析方法指导原则的有关规定。

2.6大鼠组织分布实验[13,14]20只SD大鼠，随机分为4组，按每个时间点5只大鼠实验。取“1.3”项下混悬药液以20 mg/kg按大鼠体重分别灌胃给药。随后在所设计的时间点，断颈处死大鼠，迅速取出肺、肝、肾、心、脑和小肠，按“1.4”项下方法处理，备用。按“1.5”项下测定大鼠各组织器官在各时间点浓度。结果显示，间尼索地平主要分布在大鼠小肠、肺和心中，且30和150 min时各组织中浓度均较90 min高。见表2。

表2大鼠口服20 mg/kg间尼索地平消旋体各时间点

各组织样本中分布浓度

组织10min30min90min150min小肠1.21±0.341.43±0.520.53±0.251.38±0.67肺0.53±0.210.51±0.340.08±0.070.26±0.11心0.32±0.120.76±0.280.33±0.340.24±0.13肾0.05±0.040.08±0.060.05±0.020.04±0.03肝0.15±0.070.34±0.240.08±0.060.10±0.12脑0.06±0.070.09±0.010.06±0.050.05±0.04

3讨论

高血压已成为临床常见病和引发心脑血管并发症最严重的疾病之一，而有效抗高血压药物治疗可以预防由高血压引起的脑血管意外、心功能衰竭和肾功能不全，并明显降低其病死率。由于部分高血压患者并无明显的临床症状，高血压又被称为人类健康的“无形杀手”，所以提高对高血压病的认识，对早期预防、及时治疗有极其重要的意义。因此研制高效的治疗高血压的药物是亟待解决的问题。

3.1钙拮抗剂是目前治疗高血压和心绞痛的主要药物。其中二氢吡啶类钙拮抗剂(DHP-CaA)特异性高、作用强，发展迅速，临床效果良好，与其他类型的降压药可联合应用以增强疗效，具有广阔的市场前景。

本实验中间尼索地平消旋体作为二氢吡啶类钙拮抗剂，药理作用与尼索地平相似[3-5]，而光稳定性明显优于德国公司研制的尼索地平，具有自身优势，有巨大的开发潜力。

3.2本文首先采用甲醇、乙腈沉淀蛋白的方法对组织样品进行处理，萃取回收率低于50%，且在间尼索地平消旋体出峰的位置有内源性物质干扰，因此采用液-液萃取法对组织样品进行纯化，分别考察了正己烷、环己烷、甲苯、乙酸乙酯、正己烷-乙醚(1∶1)、乙醚、正己烷-乙酸乙酯(1∶1)的提取效果。除乙醚，正己烷和正己烷-乙醚(1∶1)萃取内源性物质无干扰外，其余均有干扰峰出现。考虑乙醚的沸点低，不宜精密量取，正己烷-乙醚(1∶1)经试验证实，易于量取且回收率高于70%，因此采用正己烷-乙醚(1∶1)作组织样本预处理的萃取溶剂[15,16]。

3.3由组织分布结果可见，间尼索地平消旋体在小肠分布居多，可能与大鼠口服用药有关，同时也说明该药可能对小肠吸附性较强，在肠道菌产生的多种消化酶和酵素作用下，可能会转化为代谢物。在大鼠脑组织中测到部分原型药物，说明该药能够透过血脑屏障，进而进入脑组织中。同时，肺和脑组织中均存在有一定量的间尼索地平消旋体，表明了该药脂溶性较大。此外，小肠、心和肺组织中药物分布浓度较高，这些组织既是主要效应器官，也是药物产生毒性的重要部位。因此，对该药进行药效学和毒理学研究势在必行。

3.4鉴于间尼索地平消旋体在小肠、肺和肝组织中，30和150 min的浓度均较90 min高，因此该药在大鼠体内很可能存在肝肠循环。肝肠循环又称为肠肝循环，指经胆汁或部分经胆汁排入肠道的药物，在肠道中又重新被吸收，经门静脉又返回肝脏的现象。此现象主要发生在经胆汁排泄的药物中，有些由胆汁排入肠道的原型药物如毒毛旋花子苷G，极性高，很少能再从肠道吸收，而大部分从粪便排出。有些药物如氯霉素、酚酞等在肝内与葡萄糖醛酸结合后，水溶性增高，分泌入胆汁，排入肠道，在肠道细菌酶作用下水解释放出原型药物，又被肠道吸收进入肝脏。因此对间尼索地平在大鼠体内的吸收、分布、代谢、排泄过程有必要进行深入的研究。

3.5本文采用液-液萃取对样品进行预处理，首次建立了液质联用技术测定大鼠组织中间尼索地平消旋体含量的分析方法，研究了该药在大鼠各组织中的分布特征。所建立方法准确、快速、灵敏度高，为临床研究与设计给药方案提供参考。

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(收稿日期：2015-12-17)

【中图分类号】R 912

【文献标识码】A

【文章编号】1002-7386(2016)09-1423-03

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.09.048

项目来源：河北省医学科学研究重点课题(编号：20130069)