杨蓉　常亮　王亚玲　苗成龙　贾妍　李拥军

050000　石家庄市,河北医科大学第二医院心内科



·论著·

AT1-R-JAK/STAT信号通路对肥大心肌细胞表达内脂素的调节

杨蓉常亮王亚玲苗成龙贾妍李拥军

050000石家庄市,河北医科大学第二医院心内科

【摘要】目的观察心肌细胞肥大过程中应用不同的信号通道阻断剂阻断AngⅡ作用后内脂素的表达情况，研究内脂素水平变化的意义。方法采用SD乳鼠(出生2～3 d)，利用差速贴壁法提取原代心肌细胞并进行培养，48 h 后改为无血清的培养基继续培养，24 h后分组。分别应用不同的信号通道阻断剂阻断AngⅡ的干预作用。应用RT-PCR、Western-Blot技术检测心肌细胞中内脂素表达情况，应用Western-Blot技术检测心肌细胞脑氨钠素(BNP)表达情况。结果心肌细胞活力(光密度值)和BNP表达水平在AngⅡ浓度为10(-8)、10(-7)、10(-6) mol/L时逐渐升高，AngⅡ浓度为10(-6) mol/L时达峰值，而AngⅡ浓度升高为10(-5) mol/L时心肌细胞活力下降，BNP表达水平下降。内脂素和内脂素mRNA水平，在AngⅡ浓度为10(-8)、10(-7)、10(-6) mol/L时呈逐渐升高趋势，AngⅡ浓度为10(-5) mol/L时达峰值。在AngⅡ浓度为10(-6) mo1/L时，心肌细胞活力、内脂素mRNA表达和内脂素蛋白表达与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。心肌细胞MTT产物(OD值)、内脂素mRNA和蛋白表达、BNP蛋白表达水平，随时间延长而增加。PD123319预干预组和AngⅡ干预组内脂素mRNA和蛋白表达水平明显高于对照组和替米沙坦预干预组(P<0.05)。AngⅡ组内脂素mRNA和蛋白表达水平与对照组、AG490+AngⅡ组、SP600125+AngⅡ组和U0126+AngⅡ组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，AG490+AngⅡ组、SP600125+AngⅡ组和U0126+AngⅡ组明显高于对照组(P<0.05)。结论在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大中内脂素表达的增加，由AT1-R-JAK/STAT信号通路所介导。

【关键词】心肌细胞；内酯素；血管紧张素；肥大

心肌肥厚常常为适应机体做功的不断增加而发生的适应性改变，这种快速肥厚性反应具有一定的代偿效果。在代偿反应过程中，交感神经兴奋、肾素-血管紧张素-醛固酮系统的激活发挥了重要作用。其中，血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是导致心肌细胞肥大的主要影响因子之一[1]。短期内观察，肥大的心肌可以维持甚至增加心输出量，但随着心肌肥大的发展，心肌氧耗量也会进一步增加，从长远来看，“代偿性”肥大终将发展为“失代偿性”心脏扩大，出现心肌纤维化和细胞凋亡，冠状动脉血流储备也将随之而降低，导致心功能下降，心力衰竭的发生。研究表明，AngⅡ可以激活多条细胞内信号传导通路，导致非依赖压力超负荷性的心肌细胞肥大和机械性功能紊乱[2,3]，即使无高压力负荷的情况下也具有直接的促进心肌细胞肥大的效应。心肌细胞肥厚的过程中常伴随着肥厚基因的过表达及相关蛋白质合成的增加，其中脑钠素(brain natriuretic peptide，BNP)是反应心肌肥厚及心力衰竭的代表性生化标志物[4,5]。内脂素在人体多种组织广泛表达,在风湿性疾病、肥胖、糖尿病、炎性反应等病理生理情况下，血浆内脂素水平明显升高。笔者所见内脂素在心血管系统的作用也有很多报道，但多局限于体内实验，目前有关内脂素在心脏细胞水平的表达，及其在心肌细胞肥大中的作用及其机制的研究笔者未见报道。本研究观察在AngⅡ刺激下肥大心肌细胞中内脂素的表达情况，以及可能的病理生理机制，以探讨内脂素在心肌肥厚进程的作用，为临床心力衰竭患者开拓新的诊治思路。

1材料与方法

1.1主要仪器及试剂(1)仪器：PCR仪(ABI公司)，恒温振荡器(THZ-C,中国江苏太仓试验设备厂)，GDS-8000凝胶成像分析系统(美国UVP公司)。(2)试剂胎牛血清(中国北京索来宝公司)，D-葡萄糖(分析纯,重庆北碚化学试剂厂)，BNP兔抗鼠一抗(美国Abcam公司)，Trizol试剂(SBS公司)，Visfatin一抗:山羊抗大鼠sc-46400(美国Santa公司)。

1.2细胞提取及培养选取河北医科大学实验动物中心提供的Sprague-Dawley(SD)大鼠，日龄2～3 d，雌雄不分，清洁级。剪取乳鼠心脏前1/3的心室部分，利用差速贴壁法分离出心肌细胞。使用5-BrdU驱除成纤维细胞的干扰。

1.3分组及处理心肌细胞首先进行48 h常规原代培养，24 h后改为无血清培养基继续培养。之后将6孔板上的细胞每6孔分为1组，换培养基的同时进行分组。首先分为：对照组、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L AngⅡ干预心肌细胞48 h。然后，根据上述分组实验结果选取对内脂素和BNP影响最大的AngⅡ浓度分别干预心肌细胞：0、6、12、24、48 h。最后，根据上述前期实验结果选取对内脂素和BNP影响最大的AngⅡ浓度(10-6mol/L)干预心肌细胞24 h，分别应用不同的信号通道阻断剂阻断AngⅡ的作用：(1)首先应用替米沙坦(10 μmol/L)和PD123319 (10 μmol/L)分别阻断AngⅡ 1型受体(AngⅡ type-1 receptor,AT1-R)和AngⅡ 2型受体(AngⅡ type-2 receptor,AT2-R)。心肌细胞首先应用替米沙坦和PD123319预干预30 min，随后应用AngⅡ(10-6 mol/L)干预24 h。(2)应用SP600125、U0126和AG490，分别阻断AT1-R下游通道：JNK(c-Jun NH 2-terminal kinase)、ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinase)和JAK(Janus kinase)。细胞首先应用SP600125(10 μmol/L)、U0126(10 μmol/L)和AG490预干预30 min，随后应用AngⅡ(10-6mol/L)干预24 h。

1.4RT-PCR方法检测心肌细胞内脂素mRNA的表达美国medline国立图书馆基因库检索基因，引物由赛百盛生物工程技术服务有限公司合成。内脂素(上游引物5-ACTTTGAATGCCGTGAA-3，下游引物5-AATCCAGTTGGTGAGCC-3。GAPDH上游引物5-GAGGCTCTCTTCCAGCCTTC-3，下游引物5-AGGGTGTAAAAGCAGCTCA-3)。采用TRIZOL法遵照SBS公司相关说明书进行心肌细胞总RNA的提取,取8 μl扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳；凝胶图像分析系统进行吸光度扫描，结果以内脂素与GAPDH光密度的比值表示。

1.5Western blot方法分析检测内脂素及BNP蛋白的表达胰酶消化收集心肌细胞于离心管中，离心后加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂RIPA，离心后用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白含量，分装上清用于加样。配制9%的分离胶及4%的浓缩胶，将总蛋白加至上样孔中，进行SDS-PAGE恒压电泳，染色转膜后，杂交、显色，用封闭液将一抗稀释。包被一抗、二抗，膜用TBST液洗3次，每次5 min。用ECL发光试剂盒进行显色。洗涤好的膜摆放到保鲜膜上，将底物工作液加到膜上后立即用保鲜膜包好，迅速放入暗盒中进行曝光。暗室中小心的将X线片压到膜上，适当曝光，显影，定影。凝胶图像分析系统进行吸光度扫描。

1.6MTT法检测心肌细胞活力心肌细胞以1×105/ml的密度种植于96孔细胞培养板中，按照实验方法处理心肌细胞后，加入5 mg/ml MTT溶液20 μl与培养基中，在37℃条件下继续培养4 h，之后每孔加入150 μl的DMSO，并震荡10 min，将96孔细胞培养板置入全自动酶标仪，在490 nm波长处测定其光吸收值。

2结果

2.1AngⅡ干预48 h后心肌细胞活力及内脂素和BNP的变化

2.1.1心肌细胞活力(光密度值)和BNP表达水平:在AngⅡ浓度为10-8、10-7、10-6mol/L时呈逐渐升高趋势，AngⅡ浓度为10-6mol/L时达峰值，而AngⅡ浓度升高为10-5mol/L时心肌细胞活力下降，BNP表达水平下降。

2.1.2内脂素和内脂素mRNA水平:在AngⅡ浓度为10-8、10-7、10-6mol/L时呈逐渐升高趋势，AngⅡ浓度为10-5mol/L时达峰值，在AngⅡ浓度升高为10-4mol/L 时内脂素和内脂素mRNA水平均升高，但与AngⅡ浓度为10-5mol/L时比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1～3，图1。

表1不同浓度AngⅡ浓度干预48 h的情况

指标对照组AngⅡ10-8mol/LAngⅡ10-7mol/LAngⅡ10-6mol/LAngⅡ10-5mol/L心肌细胞活力0.793±0.0490.966±0.50*1.099±0.047*1.181±0.042*1.040±0.053*BNP蛋白质表达0.153±0.0150.248±0.007*0.356±0.015*0.467±0.003*0.410±0.017*内脂素mRNA表达0.497±0.0060.506±0.0050.627±0.012*0.690±0.011*0.700±0.010*内脂素蛋白质表达0.250±0.0100.263±0.0060.744±0.011*0.919±0.022*0.942±0.016*

注：与对照组比较，*P<0.01

表2AngⅡ浓度10-6mol/L干预心肌细胞不同时间情况

指标对照组6h12h24h48h心肌细胞活力0.753±0.0321.034±0.039*1.261±0.052*1.214±0.031*1.173±0.053*BNP蛋白质表达0.157±0.0060.164±0.0140.192±0.009*0.405±0.005*0.387±0.015*

注：与对照组比较，*P<0.01

表3AngⅡ浓度10-6mol/L干预心肌细胞不同时间情况

指标6h对照组AngⅡ12h对照组AngⅡ24h对照组AngⅡ48h对照组AngⅡ内脂素mRNA表达0.506±0.0180.552±0.017*0.484±0.0170.564±0.017*0.512±0.0180.756±0.041*0.507±0.0180.685±0.012*内脂素蛋白质表达0.243±0.0060.572±0.020*0.240±0.0050.577±0.023*0.247±0.0060.984±0.027*0.250±0.0100.927±0.015*

注：与对照组比较，*P<0.01

图1不同浓度AngⅡ 干预48 h，(A) 心肌细胞活力变化；(B) BNP蛋白质的表达；(C)内脂素mRNA表达；(D) 内脂素蛋白质表达。1, 对照组; 2, AngⅡ 10-8mol/L; 3, AngⅡ 10-7mol/L; 4, AngⅡ 10-6mol/L; 5, AngⅡ 10-5mol/L

2.2AngⅡ浓度为10-6mol/L时心肌细胞不同时间活力及内脂素和BNP的变化心肌细胞在AngⅡ浓度为10-6mol/L时，心肌细胞活力、内脂素mRNA表达和内脂素蛋白表达与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。心肌细胞MTT产物(OD值)、内脂素mRNA和蛋白表达、BNP蛋白表达水平，随时间延长而增加，其中心肌细胞MTT产物(OD值)在12 h达峰值，内脂素mRNA和蛋白表达、BNP蛋白表达水平在24 h达峰值，前者在48 h后显著下降，后者下降轻微。见表4，图2。

表4AngⅡ10-6mol/L刺激心肌细胞24 h情况

指标对照组AngⅡ替米沙坦+AngⅡPD123319+AngⅡ内脂素mPNA表达0.493±0.0060.763±0.015*0.500±0.0100.790±0.017*内脂素蛋白质表达0.265±0.0130.977±0.021*0.270±0.0171.018±0.015*

注：对照组比较，*P<0.01

2.3受体拮抗剂对内脂素mRNA和内脂素蛋白质表达的影响PD123319预干预组和AngⅡ干预组内脂

图2AngⅡ浓度10-6mol/L干预心肌细胞不同时间，观察(A) 心肌细胞活力变化；(B)内脂素mRNA表达； (a, 对照; b, AngⅡ)(C)内脂素蛋白质的表达 (a, 对照; b, AngⅡ)；(D)BNP蛋白质的表达变化。1, 对照组; 2, 6 h; 3, 12 h; 4, 24 h; 5, 48 h

素mRNA和蛋白表达水平明显高于对照组和替米沙坦预干预组(P<0.05)，替米沙坦预干预组与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。PD123319预干预组内脂素mRNA和内脂素蛋白质表达水平高于AngⅡ干预组，但差异无统计学意义(P>0.05)。AngⅡ组内脂素mRNA和蛋白表达水平与对照组、AG490+AngⅡ组、SP600125+AngⅡ组和U0126+AngⅡ组

比较，差异有统计学意义(P<0.05)，AG490+AngⅡ组、SP600125+AngⅡ组和U0126+AngⅡ组明显高于正常对照组(P<0.05)，AG490+AngⅡ组内脂素mRNA和蛋白表达水平与SP600125+AngⅡ组和U0126+AngⅡ组比较，差异有统计学意义(P>0.05)。见表4、5，图3。

表5AngⅡ10-6mol/L刺激心肌细胞24 h情况

指标AG490AG490+AngⅡU0126U0126+AngⅡSP600125SP600125+AngⅡ对照组AngⅡ内脂素蛋白质表达0.247±0.0180.312±0.020*0.249±0.0170.798±0.023*0.260±0.0180.811±0.026*0.246±0.0120.951±0.041*内脂素mRNA的表达0.499±0.0200.496±0.027 0.510±0.0230.500±0.027 0.739±0.035*0.551±0.011*0.637±0.022*0.650±0.016*

注：与对照组比较，*P<0.01

图3AngⅡ 10-6mol/L刺激心肌细胞24 h，应用AngⅡ受体拮抗剂对(A)内脂素mRNA表达和(B)内脂素蛋白质的表达的影响；(1, 对照组; 2, AngII; 3, 替米沙坦+AngⅡ; 4, PD123319+AngⅡ)。AngⅡ 10-6mol/L刺激心肌细胞24 h，应用不同信号转导通路抑制剂对(C)内脂素蛋白质表达和(D)内脂素mRNA的表达的影响；(AG490 (20 μmol/L), U0126 (20 μmol/L) or SP600125 (20 μmol/L)

3讨论

研究发现，BNP虽然在心脏等多种组织中均有表达，但通常情况下，表达水平比较低。但当心肌张力明显增高时，BNP在心室中表达水平迅速增加。常通过激活PKG、pGC、KATP通道发挥作用[6]。本实验采用AngⅡ对心肌细胞进行刺激，使心肌细胞肥大，对BNP蛋白表达进行检测，从而评估心肌细胞的状态。

内脂素作为生长刺激因子，主要分布于肌肉、肝脏、骨髓间质细胞等，心脏也可产生，并对心脏产生作用，其可以发挥类胰岛素作用、促进细胞增殖和抗凋亡等作用[7,8]。本研究发现，AngⅡ作用可导致心肌细胞内内脂素和BNP表达水平的增长，且与AngⅡ作用的剂量和时间相关，其中内脂素水平升高可能与AngⅡ作用心肌细胞，后者耗氧量增加有关。Hsu等[9,10]研究表明AngⅡ能够导致心肌细胞凋亡，而内脂素能对其产生抑制作用。上述结论可以推断，心肌细胞凋亡在一定程度上能够引起内脂素水平升高。

AngⅡ受体中AngⅡ I型受体和AngⅡⅡ型受体通过不同的作用机制，均可导致心肌细胞肥大[11]。替米沙坦和PD123319分别是AT1-R和 AT2-R特异性阻断剂。本研究发现，替米沙坦可以抑制AngⅡ引起的心肌细胞内内脂素水平的升高，说明AngⅡ引起的心肌细胞肥大是由AT1-R介导内脂素表达增加而产生的[12]。本研究中AngⅡ作用可导致心肌细胞内内脂素和BNP表达水平的增长，且与AngⅡ作用的剂量和时间相关，其中内脂素水平升高可能与AngⅡ作用心肌细胞，后者耗氧量增加有关。而AT2-R基因的过度表达可以抑制心肌细胞的耗氧量增加。由此推断，AT1-R可以增加心肌细胞蛋白质合成、减少凋亡[13]。而AT2-R在抑制心肌细胞肥大和促进心肌细胞凋亡中发挥重要作用[14,15]。

AngⅡ是肾素-血管紧张素系统的主要活性肽，其通过受体AT1使心肌细胞蛋白合成速度增加，心肌纤维细胞的基质和分泌水平升高，从而发生心肌肥厚，甚至发生心肌纤维化，影响患者的心脏功能。AT1-R阻断剂能够抑制内脂素水平升高，阻断心肌肥厚发生的通路。

研究发现，在乳鼠心肌细胞中AngⅡ可以通过AT1-R激活JNK[16]。ERK是与AngⅡ诱导的心肌细胞肥大密切相关的MAPK家族的关键成员[17]。JAK/STAT是另外一个与AngⅡ诱导的心肌细胞肥大密切相关的信号通道，并且与MAPK家族不同。最近研究发现，JAK/STAT信号通路在心脏病理性肥厚中发挥关键作用。而且，JAK/STAT信号通路在AngⅡ的自分泌环中发挥重要作用，这个环路可以放大AngⅡ对心肌细胞的作用[18]。本研究可能是由于AG490阻断了JAK/STAT介导的AngⅡ的自分泌环，阻断了心肌内源性AngⅡ分泌。说明AngⅡ诱导的心肌细胞肥大过程中内脂素表达的增加主要是由JAK/STAT信号通路介导的。

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The regulation effects of AT1-R-JAK/STAT signal pathway on expressions of visfatin in hypertrophy myocardial cells in vitro

YANGRong,CHANGLiang,WANGYaling,etal.

TheSecondHospotalofHebeiMedicalUniversity,Hebei,Shijiazhuang050000,China

【Abstract】ObjectiveTo observe the expressions of visfatin in angiotensin Ⅱ(AngⅡ)-induced cardiomyocyte hypertrophy in vitro after blocked by different signal channel blockers,and to explore the significance of changes of visfatin levels.MethodsThe primary generation cardiomyocytes from Sprague-Dawley (SD) neonate rats (2～3d age) were cultured in vitro with routine medium,however, which were cultured in medium without serum after 48 hours. The cardiomyocytes were divided into different groups after 24 hours,and the intervention effects of AngⅡ were blocked by different signal channel blockers. The expression levels of visfatin in cardiomyocytes were detected by RT-PCR,Western-Blot,respectively,moreover, the expression levels of brain natriuretic peptide (BNP) in cardiomyocytes were detected by Western-Blot.ResultsThe activity of cardiomyocytes (optical density value,OD) and expression levels of BNP were gradually increased when AngⅡ concentration at 10(-8),10(-7),10(-6)mol/L.The activity of cardiomyocytes and expression levels of BNP were decreased when AngⅡ concentration at 10(-5)mol/L.The levels of visfatin and visfatin mRNA were increased when AngⅡ concentration at 10(-8),10(-7),10(-6)mol/L,which reached peak at 10(-5)mol/L. There were significant differences in the activity of cardiomyocytes and expression levels of visfatin mRNA and protein when AngⅡ concentration at 10(-6)mol/L between experimental group and control group (P<0.05).The OD value of cardiomyocytes,expression levels of visfatin mRNA and protein,expression levels of BNP protein were increased,with the time went on.The expression levels of visfatin mRNA and protein in PD123319 intervention group and AngⅡ intervention group were significantly high than those in control group and telmisartan intervention group (P<0.05). There were significant differences in the expression levels of visfatin mRNA and protein between AngⅡ group and control group and between AG490+AngⅡ group,SP600125+ AngⅡgroup and U0126+AngⅡgroup (P<0.05), moreover,which in AG490+AngⅡ group,SP600125+ AngⅡ group and U0126+AngⅡ group were significantly higher than those in control group (P<0.05).ConclusionThe enhancement of visfatin expression levels in AngⅡ-induced cardiomyocyte hypertrophy is mediated by AT1-R-JAK/STAT signal pathway.

【Key words】cardiomyocyte;visfatin;angiotensin;hypertrophy

(收稿日期：2015-11-22)

【中图分类号】R 329.2

【文献标识码】A

【文章编号】1002-7386(2016)09-1292-05

通讯作者：常亮，050000石家庄市，河北医科大学第二医院心内科；

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.09.003

E-mail:mrmist0920@163.com