任公平，那 辉，佟 雷，李华洋

（1.牡丹江医学院红旗医院，黑龙江牡丹江 157011；2.黑龙江幼儿师范高等专科学校，黑龙江牡丹江 157011；3.牡丹江医学院药学院，黑龙江牡丹江 157011）

辣椒素通过下调COX－2和mPGES－1抑制IL－1β诱导的NCI－H460细胞PGE2含量的实验研究

任公平1，那 辉2，佟 雷3，李华洋1

（1.牡丹江医学院红旗医院，黑龙江牡丹江 157011；2.黑龙江幼儿师范高等专科学校，黑龙江牡丹江 157011；3.牡丹江医学院药学院，黑龙江牡丹江 157011）

目的 观察辣椒素对IL－1β诱导的人肺腺癌NCI－H460细胞PGE2含量的影响，并且进一步观察其对COX－2和mPGES－1的影响，探讨其抗非小细胞肺癌（NSCLC）的可能机制。方法 体外培养NCI－H460细胞，采用MTT比色分析法，观察辣椒素对NCI－H460细胞增殖抑制作用，计算IC50；采用IL－1β刺激的方法构建炎症模型，ELISA法检测辣椒素对NCI－H460细胞PGE2含量和COX－2活性的影响；Western blot法检测辣椒素对NCI－H460细胞COX－2、mPGES－1蛋白表达的影响；Real－time PCR法检测辣椒素对NCI－H460细胞COX－2mRNA和mPGES－1mRNA表达的影响。结果 MTT比色分析结果表明，辣椒素对NCI－H460细胞增殖具有明显抑制作用，与对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。辣椒素明显降低NCI－H460细胞COX－2活性和PGE2浓度，而且明显降低NCIH460细胞COX－2、mPGES－1蛋白及其mRNA的表达，且呈剂量依赖性，与模型组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论 辣椒素通过降低NCI－H460细胞COX－2和mPGES－1mRNA表达从而抑制PGE2释放，可能是其抗NSCLC的机制之一。

辣椒素；非小细胞肺癌；环氧化酶－2（COX－2）；微粒体型前列腺素E合成酶－1（mPGES－1）；前列腺素E2（PGE2）

肺癌是如今最常见的恶性肿瘤，也是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。在中国，肺癌每年大约致40万例患者死亡，已经成为严重的社会问题［1－2］。在肺癌的病理学分型中，80％是非小细胞肺癌（non－small cell lung cancer，NSCLC），包括腺癌、鳞状上皮细胞癌和大细胞癌，为当今对人类健康和生命危害最大的恶性肿瘤之一［3］，给患者和社会带来极大的经济负担。近年来，关于辣椒素（capsaicin，CAP）抗癌作用的研究在国内外日益受到学者的高度重视。辣椒素是红辣椒的一种活性成分。有研究表明，辣椒素可以抑制癌症细胞的增殖，促进凋亡，提示可以作为一种化疗药物或化疗辅助用药［4－5］。虽然辣椒素具有抗癌作用，但是其有关于NSCLC的研究依然鲜见报道。研究发现，肺癌可能源自慢性炎症反应［6］。前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）是人体中表达量最高的前列腺素，在机体炎症和发热的病理生理过程中起着关键作用。而环氧化酶－2（cyclooxygenase－2，COX－2）作为PGE2合成通路的限速酶与肺癌的关系非常密切，但是PGE2合成通路上的其他酶，尤其是下游微粒体型前列腺素E合成酶－1（microsomal prostaglandin E synthase－1，mPGES－1）是否参与了肺癌的发生过程则少见报道。故此，本研究采用体外IL－1β刺激人肺腺癌NCI－H460细胞的方法，构建炎症模型，旨在观察辣椒素对NCI－H460细胞PGE2含量、COX－2活性及对mPGES－1的影响，探讨其抗NSCLC的可能机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 人大细胞肺癌细胞NCI－H460购自中科院上海细胞库；辣椒素（纯度＞99％）购自美国Sigma公司；选择性COX－2抑制剂尼美舒利和mPGES－1抑制剂MK886购自美国Biomol公司；RPMI－1640培养基购自美国HyClone公司；牛血清白蛋白（BSA）购自PAA公司；二甲基亚砜（DMSO）和白细胞介素－1β（IL－1β）购自徐州试剂二厂；COX－2和PGE2ELISA测定试剂盒购自美国Cayman Chemical公司；兔抗人COX－2抗体和兔抗人mPGES－1抗体购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶标记抗鼠IgG二抗购自美国Santa Cruz公司。其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.2 细胞培养 NCI－H460细胞保存在含有100 mL/L BSA的RPMI－1640营养培养基（含L－谷氨酰胺、青霉素100U/mL和链霉素100μg/mL），37℃、50mL/L CO2及饱和湿度下培养。当NCI－H460细胞达80％汇合度时，用0.5g/L胰蛋白酶/0.5g/L EDTA消化。按照2×106个细胞/孔接种于超低吸附6孔板中，37℃、50mL/L CO2及饱和湿度下培养48h。收集悬浮的细胞经EDTA处理制备成单细胞悬液，然后用RPMI－1640培养液洗涤细胞。收集对数生长期细胞，备用。

1.3 实验药物 辣椒素溶解于DMSO，配成300 μmol/L溶液，－20℃保存。临用时，以完全培养液稀释到所需浓度。

1.4 炎症模型的构建 取对数生长期NCI－H460细胞，按照1×104个细胞/孔接种于96孔板中，37℃、50mL/L CO2及饱和湿度下过夜培养。实验分为5组，模型组：每孔加入DMSO和30μg/L的IL－1β；低剂量组：每孔加入100μmol/L辣椒素和30μg/L的IL－1β；中剂量组：每孔加入200μmol/L辣椒素和30 μg/L的IL－1β；高剂量组：每孔加入300μmol/L辣椒素和30μg/L的IL－1β；对照组：每孔加入等体积DMSO。每组设6个平行孔。37℃、50mL/L CO2及饱和湿度下培养24h后，用于除MTT比色分析外的实验。

1.5 MTT比色法测定细胞抑制率 取对数生长期NCI－H460细胞，按照1×104个细胞/孔接种于96孔板中，总体积为200μL，过夜培养。次日，实验组每孔加入终浓度为100、200、300、400、500μmol/L的辣椒素，对照组除未加辣椒素外，其余条件与实验组完全一致。每组设6个平行孔，将培养板置于37℃、50mL/L CO2及饱和湿度下培养，分别培养24、48h后，每孔加入MTT溶液（5g/L）20μL，37℃、50mL/L CO2及饱和湿度下继续培养4h终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，然后每孔加入DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解，570nm波长处，以空白培养液调零点，酶标仪测定吸光度（A）值，取6孔平均值。抑制率＝（1－A实验组/A对照组）×100％。在Graphpad prism 5统计软件中计算出半数抑制浓度（IC50）。

1.6 PGE2浓度的测定 NCI－H460细胞经辣椒素和IL－1β处理24h后，加入10μmol/L花生四烯酸，37℃、50mL/L CO2及饱和湿度下培养30min，按照PGE2ELISA试剂盒说明书步骤操作，490nm波长，9602G酶标仪测定吸光度（A）值。每份样品检测3次。

1.7 COX－2活性的测定 NCI－H460细胞经药物处理24h后，加入预冷的1mmol/L EDTA溶液（含10mL/L BSA），4℃、2 000r/min（R＝8.5cm）离心10min，取沉渣加入10mmol/L Tris－HCl（pH＝7.5）100μL，冰浴超声3×4s后，4℃1 0000r/min（R＝8.5cm）离心15 min，取上清。按照COX－2ELISA试剂盒说明书检测COX－2活性。每份样品检测3次。

1.8 Western blot检测 NCI－H460细胞经药物处理24h后，用细胞裂解液（20mmol/L Tris－HCl，1.5 mL/L Triton X－100，150mmol/L NaCl，10％甘油，1mmol/L Na4P2O7，50 mmol/L NaF，1 mmol/L PMSF）和蛋白酶抑制剂（5μmol/L AEBSF－HCl，5μmol/L EDTA，10mmol/L leupeptin，1.5mmol/L E－64，pH＝7.4）裂解细胞后，收集裂解液，Bradford法测定蛋白质含量。取20μg蛋白质加入2×上样缓冲液，95℃变性5min。随后进行75g/L SDS－PAGE凝胶电泳。电泳后，电转至0.45μm硝酸纤维素膜，用含50g/L的脱脂奶粉PBST（25mmol/L Tris，pH ＝7.5，150mmol/L NaCl，1g/L Tween20）封闭1h，分别加入兔抗人COX－2抗体，兔抗人mPGES－1抗体（1∶1 000稀释）4℃孵育过夜，PBST洗涤3次，每次5min。加入HRP标记的二抗（1∶2 000稀释）室温孵育2h，PBST洗涤3次，每次5min。按同样的方法与β－actin抗体孵育。ECL化学发光试剂显色，通过Bio－Rad凝胶成像进行目的条带的表达检测及分析。蛋白的相对表达强度＝目标蛋白表达强度/βactin蛋白表达强度。每份样品检测3次。

1.9 Real－time PCR检测 NCI－H460细胞经药物处理24h后，按照Trizol试剂盒说明书抽提总RNA。Nanodrop2000检测RNA纯度。使用M－MLV逆转录试剂盒（Reverse transcriptase kit promega，Japan）进行逆转录反应，成单链的cDNA，操作按照试剂盒说明书进行。利用PubMed查找相关基因序列，并利用引物合成软件Primer Premier 5.0设计引物，引物序列见表1。使用Quant SYBR Green PCR kit按照PCR引物进行扩增，用Applied Biosystems 7500型定量PCR仪测出ΔC值及熔解曲线，计算出相对基因表达量。每份样品检测3次。

表1 Real－time PCR序列Tab.1 Real－time PCR sequence

1.10 统计学分析 采用Graphpad5.0软件进行描述性统计。计量资料用珔x±s表示。资料呈正态分布且方差齐性时，多组间均数比较，采用One－way－ANOWA分析，组间两两比较，采用SNK－q检验；资料呈非正态分布或（和）方差不齐时，进行变量变换后采用One－way－ANOWA分析或SNK－q检验。检验水准α＝0.05。

2 结果

2.1 辣椒素对NCI－H460细胞增殖的影响 MTT结果显示，不同终浓度（100～500μmol/L）的辣椒素分别作用于NCI－H460细胞24h和48h后，随着终浓度的增大和作用时间的延长，其对细胞的抑制率也明显增强，呈浓度和时间依赖性，终浓度为200～500 μmol/L的辣椒素与对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01，表2）。辣椒素作用24h和48h的IC50分别为366.2μmol/L和328.2μmol/L。因24h的IC50＞300μmol/L，故此后续实验均采用≤300μmol/L为辣椒素处理浓度。

表2 辣椒素对NCI－H460细胞增殖的影响Tab.2 The effect of capsaicin on the proliferation of NCI－H460cells （珔x±s，n＝6）

2.2 辣椒素对NCI－H460细胞PGE2含量的影响模型组PGE2浓度显著升高，与对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）；中剂量组和高剂量组PGE2浓度显著降低，且呈剂量依赖性，与模型组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；低剂量组PGE2浓度虽然降低，但是与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05，表3）。

表3 辣椒素对NCI－H460细胞PGE2含量及COX－2活性的影响Tab.3 The effect of capsaicin on PGE2 concentration and COX－2activity of NCI－H460cells （珔x±s，n＝3）

2.3 辣椒素对NCI－H460细胞COX－2活性的影响模型组COX－2活性显著增强，与对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）；中剂量组和高剂量组COX－2活性显著减弱，且呈剂量依赖性，与模型组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；低剂量组COX－2活性虽然减弱，但是与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05，表3）。

2.4 辣椒素对NCI－H460细胞COX－2和mPGES－1蛋白表达的影响 Western blot结果显示，模型组COX－2和mPGES－1蛋白表达升高，与对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）；中剂量组和高剂量组COX－2和mPGES－1蛋白表达显著降低，且呈剂量依赖性，与模型组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；低剂量组COX－2和mPGES－1蛋白表达虽然降低，但是与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05，图1）。

图1 辣椒素对NCI－H460细胞COX－2和mPGES－1蛋白表达的Western blot结果Fig.1Western blot analysis results of capsicin’s effect on COX－2 and mPGES－1protein expression in NCI－H460cells

2.5 辣椒素对NCI－H460细胞COX－2mRNA和mPGES－1mRNA表达的影响 Real－time PCR分析显示，模型组COX－2mRNA和mPGES－1mRNA的表达显著上调，与对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）；中剂量组和高剂量组COX－2mRNA和mPGES－1mRNA的表达显著下调，且呈剂量依赖性，与模型组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；低剂量组COX－2mRNA和mPGES－1mRNA的表达虽然下调，但是与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05，图2）。

图2 辣椒素对NCI－H460细胞COX－2mRNA和mPGES－1 mRNA表达的Real－time PCR结果Fig.2Real－time PCR analysis results of capsaicin’s effect on COX－2 mRNA and mPGES－1 mRNA expression in NCIH460cells

3 讨论

肺癌是癌症患者死亡的头号杀手，5年生存率很低，仅为15％，对人类健康和生命危害极大［7］。因此，寻找治疗和预防肺癌的新方法尤为必要。慢性炎症反应在肺癌的发病过程中可能起到关键性作用。

PGE2是花生四烯酸代谢产物，是一种重要的细胞生长和调节因子，在机体炎症、发热、疼痛等病理生理过程中起重要作用。研究证实，PGE2与肿瘤关系十分密切，不仅起封闭因子作用，还可以促进肿瘤血管生成、诱导肿瘤细胞增生、抑制肿瘤细胞凋亡而促进肿瘤的发生、发展和转移［8］。环氧化酶（cyclooxygenase，COX）会使花生四烯酸大量转变为PGE2，是催化花生四烯酸转化为PGE2的限速酶［9］。COX－2和mPGES－1是PGE2合成过程中两个重要的限速酶，二者均是诱导型酶，在正常组织中均不表达或者很少表达，一般只在应激后（如感染、缺氧、致瘤物质刺激等）表达增加，参与炎症、疼痛、肿瘤等多种病理生理过程［10－11］。

COX－2是COX两种同工酶中的一种，在多种肿瘤组织中高表达，能促进癌细胞的增殖，延缓凋亡，致使癌症患者预后较差［12］。COX－2阳性表达，可促进NSCLC的发生、发展及侵袭转移［13］。而COX－2下游一个重要的基因是mPGES－1。mPGES－1是PGE2合成过程中最后一个催化酶，会被IL－1β、TNF－α等前炎症因子诱导而过表达，从而提高PGE2的生成［11］。由COX－2介导的一些病理过程，如发热反应、风湿性关节炎、组织再生和老年性痴呆等都与mPGES－1相关［14］。目前，mPGES－1被认为是一个优于COX－2的药物靶标，倍受关注［15］。另有研究证实，在肺癌中mPGES－1表达明显升高［16］。COX－2 和mPGES－1可以作为肿瘤治疗新型靶点，在临床治疗肿瘤中必将显示其治疗意义和价值，成为一条更理想更安全的干预途径。

辣椒素可通过多种途径在体内外发挥抗癌症作用，如诱导人结肠癌HCT116细胞和胰腺癌BxPC－3细胞凋亡［17－18］，抑制小细胞肺癌细胞H69和H82增殖［19］。另外还有报道称，辣椒素可下调VEGF而抑制NSCLC血管生成［20］。本研究采用MTT检测辣椒素对NCI－H460细胞增殖的影响。结果表明，辣椒素具有明显的NCI－H460细胞毒性作用，降低NCIH460细胞的增殖能力。本结果提示，辣椒素也表现出抑制NCI－H460细胞增殖的能力。

为证实辣椒素抑制NCI－H460细胞增殖作用是否与PGE2途径有关。本研究通过体外IL－1β刺激NCI－H460细胞，构建炎症模型，观察辣椒素对PGE2及COX－2和mPGES－1的影响。结果发现，在IL－1β的诱导下，NCI－H460细胞PGE2含量、COX－2活性、COX－2和mPGES－1蛋白表达及mRNA的表达均升高，本实验结果与王静媛等［15］报道相一致。给予辣椒素干预后显示，辣椒素可以降低NCI－H460细胞PGE2含量，抑制COX－2活性，进一步Western blot分析和RT－PCR分析证实，辣椒素还可以降低NCIH460细胞COX－2和mPGES－1蛋白表达和mRNA表达。以上结果提示，辣椒素可能通过下调NCIH460细胞COX－2和mPGES－1表达抑制PGE2生成而发挥抗NSCLC作用。

综上所述，COX－2和mPGES－1可能成为阻止NSCLC发生、发展的新靶点。辣椒素可降低NCIH460细胞PGE2生成而发挥抗NSCLC作用，其机制可能与下调NCI－H460细胞COX－2和mPGES－1表达有关。

（致谢：本研究在数据统计分析过程中得到黑龙江幼儿师范高等专科学校那辉老师的热情指导和帮助，特此表示感谢！）

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Experimental study of the inhibitory effect of capsaicin on PGE2concentration of IL－1βinduced NCI－H460cells by downregulating COX－2and mPGES－1

REN Gong－ping1，NA Hui2，TONG Lei3，LI Hua－yang1
（1.Hongqi Hospital of Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011；2.Heilongjiang Preschool Education College，Mudanjiang 157011；3.School of Pharmacy，Mudanjiang Medical College，Mudanjiang 157011，China）

Objective To observe the effects of capsaicin on PGE2concentration of IL－1β－induced human large cell carcinoma NCI－H460 cells，and further observe its effect on COX－2 and mPGES－1 so as to explore the possible mechanisms against non－small cell lung cancer.Methods NCI－H460 cells were cultured in vitro；the effect of capsaicin in inhibiting NCI－H460 cells proliferation was observed.The 50％inhibitory concentration（IC50）was measured by MTT assay.IL－1βstimulation method was used to construct inflammation model，and the effects of capsaicin on COX－2 activity and PGE2concentration in NCI－H460 cells were measured by ELISA.The effects of capsaicin on COX－2 and mPGES－1 protein level in NCI－H460 cells were analyzed by Western blot；the effects of capsaicin on COX－2 mRNA and mPGES－1 mRNA expressions in NCI－H460 cells were analyzed by Real－time PCR.Results MTT assay results showed that the growth of NCI－H460 cells treated with capsaicin was significantly inhibited compared with the control group（P＜0.05 or P＜0.01）.Capsaicin could significantly decrease COX－2 activity and PGE2concentration in NCI－H460 cells，and significantly decrease COX－2，mPGES－1 protein levels as well as COX－2，mPGES－1 mRNA expressions in NCI－H460 cells in a dose－dependent manner compared with the control group（P＜0.05）.Conclusion Capsaicin inhibits the release of PGE2 by downregulating COX－2 and mPGES－1 mRNA expressions in NCI－H460 cells，which may be one mechanism of its effect against non－small cell lung cancer.

capsaicin；non－small cell lung cancer；cyclooxygenase－2（COX－2）；microsomal prostaglandin E synthase－1（mPGES－1）；prostaglandin E2（PGE2）

R585.5

A

10.7652/jdyxb201602028

2014－12－31

2015－11－17

李华洋.E－mail：lihy1979@foxmail.com

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160202.1646.024.html（2016－02－02）

◇技术方法研究◇