张彦兵，朱 娇，肖菊香，郭亚焕，廖子君，徐 瑞

（西安交通大学：1.附属陕西省肿瘤医院肿瘤内科，陕西西安 710061；2.第一附属医院肿瘤内科，陕西西安 710061）

白花蛇舌草总黄酮对TGF－β1诱导的肝癌MHCC97－H细胞EMT的逆转作用及其机制

张彦兵1，朱 娇2，肖菊香2，郭亚焕1，廖子君1，徐 瑞1

（西安交通大学：1.附属陕西省肿瘤医院肿瘤内科，陕西西安 710061；2.第一附属医院肿瘤内科，陕西西安 710061）

目的 探讨白花蛇舌草总黄酮（FOD）对TGF－β1诱导肝癌细胞MHCC97－H上皮细胞间质转化（EMT）的逆转作用及其相关机制。方法 用TGF－β1诱导MHCC97－H细胞建立EMT模型，再将其分为5组：正常对照组、TGF－β1组、TGF－β1＋FOD组、TGF－β1＋5－FU组及TGF－β1＋FOD＋5－FU组，分别干预48h，Transwell侵袭小室法检测细胞体外侵袭能力，Western blot法检测各组细胞中E－cadherin、vimentin蛋白的表达。结果 与正常细胞形态相比，TGF－β1诱导后细胞呈现明显的长梭形，且侵袭能力增强（P＝0.02）；给予药物处理后，TGF－β1＋FOD组、TGF－β1＋5－FU组细胞的穿透能力较TGF－β1组减弱（P＝0.03、P＝0.02），且联合用药组减弱程度更加明显（P＝0.01）；Western blot结果显示，TGF－β1组细胞中E－cadherin蛋白表达显著降低（P＝0.01），vimentin蛋白的表达显著增加（P＝0.01），TGF－β1＋FOD组、TGF－β1＋5－FU组E－cadherin蛋白表达有所上调（P＝0.03、P＝0.02），vimentin蛋白的表达有所下调（P＝0.04、P＝0.03），且联合组变化更为显著（P＝0.01）。结论 FOD能够逆转TGF－β1诱导的肝癌MHCC97－H细胞的上皮间质转化，其机制可能与其抑制TGF－β1诱导的E－cadherin蛋白下调及上皮细胞间质转化相关。

MHCC97－H细胞；TGF－β1；上皮间质转化；白花蛇舌草总黄酮；侵袭；E－cadherin；vimentin

肝癌是我国常见的3大主要恶性肿瘤之一［1－2］，其侵袭转移是导致患者死亡的重要原因。探索肝癌侵袭转移机制，并寻找相应的治疗措施，一直是肿瘤学术界研究的重要问题。目前，细胞上皮－间质转化（epithelial－mesenchymal transition，EMT）与肝癌侵袭及转移的研究正在受到学术界的广泛关注。白花蛇舌草（oldenlandia diffusa willd）系茜科耳草属植物，具有抗炎、抗菌、增强免疫力等作用［3－4］。白花蛇舌草总黄酮（total flavones of oldenlendia diffusa willd，FOD）为白花蛇舌草中提取的有效成分，不但具有抗炎、抗菌作用，而且已经被证实对多种肿瘤具有抑制作用，尤其是消化道肿瘤。然而，FOD是不是通过抑制肿瘤细胞的EMT发挥抗肿瘤作用，目前还没有这方面的报道。因而本文主要探讨FOD对转化生长因子β1（transforming growth factor－β1，TGF－β1）诱导的MHCC97－H肝癌细胞EMT模型的逆转作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂 白花蛇舌草购自西安交通大学第一附属医院（江西产地），并经提取、分离得到FOD（采用溶剂提取法，提取、纯化总黄酮，硝酸铝络合分光光度法测得总黄酮的纯度为59.19％）；人肝癌MHCC97－H细胞（西安交通大学第一附属医院转化医学中心馈赠）；培养液DMEM（HyClone，美国）；胎牛血清（HyClone，美国）；胰蛋白酶（碧云天公司）；Transwell小室（Millipore公司）；TGF－β1购自Peprotech公司；E－cadherin、vimentin抗体均购自美国CST公司。鼠抗人β－actin单克隆抗体，标记山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG二抗均购自美国SAB公司。

1.2 主要仪器 CO2培养箱（Thermo，美国），多功能酶标仪（BMG，德国），荧光倒置显微镜（Motic，澳门）。Western blot电泳仪购自北京君意公司。全自动凝胶成像分析系统（Bio－Rad，美国）。

1.3 方法

1.3.1 肝癌MHCC97－H细胞EMT模型的建立取对数生长期的细胞，常规消化离心，用100mL/L胎牛血清的DMEM培养液重新悬浮并计数，取20× 105个细胞的悬浮液，接种于1个培养瓶中，补加适量培养基，置37℃、50mL/L CO2培养箱培养。待细胞贴壁，融合达30％～40％后，弃掉原培养液，加入5μg/mL的无血清TGF－β1培养液，继续置于37℃培养箱，并以无血清DMEM培养细胞作为对照。倒置显微镜观察诱导24、48、72h后细胞形态的改变。

1.3.2 细胞侵袭实验 MTT法检测FOD、5－FU对MHCC97－H细胞增殖的抑制作用，结果显示这两种药对细胞的抑制作用均存在时间与剂量依赖性，得出实验干预浓度为FOD：200μg/mL、5－FU：10μg/mL。然后将实验分为5组（Control组、TGF－β1组、TGF－β1＋FOD组、TGF－β1＋5－FU组及TGF－β1＋FOD＋5－FU组），首先用无血清DMEM配制各组终浓度的药物，TGF－β1诱导48h的细胞用无血清的对应组药物制成细胞悬液；分别取2×104个细胞种于Tran swell小室中，下室加入600μL含FBS的培养基，置37℃、50mL/L CO2培养箱培养。48h后取出Transwell小室，吸弃小室内液体，用棉签擦净上室细胞，PBS漂洗后40g/L多聚甲醛固定20min；5g/L结晶紫染色15min，PBS漂洗3次，倒置显微镜下观察、计数并拍照。

1.3.3 Western blot检测 采用5μg/mL的TGF－β1作用于MHCC97－H细胞，显微镜下观察，48h后，细胞形态明显改变；用一定浓度的全血清培养基、FOD、5－FU及FOD＋5－FU继续作用于EMT模型48h，同时设有阴性对照组（正常MHCC97－H细胞）；然后分别提取诱导前后及干预前后细胞的总蛋白，与5×加样缓冲液混匀，煮沸5min。取10μg蛋白，用SDS－PAGE分离电转移至PVDF膜，用现配的脱脂牛奶室温封闭2h后，加入E－钙黏蛋白（E－cadherin 1∶1 000）、波形蛋白（Vimentin 1∶1 000），4℃孵育过夜。1×PBST洗膜4次，10min/次，再加入HRP标记的二抗（1∶8 000），室温反应2h；1×PBST洗膜3次，PBS洗膜1次，ECL化学发光检测蛋白条带。

1.4 统计学处理 用SPSS18.0软件进行数据的统计学分析。实验数据以均数±标准差（珔x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD－t检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TGF－β1诱导前后MHCC97－H细胞的形态学变化及E－cadherin、vimentin蛋白的表达 与诱导前比较，经TGF－β1诱导48h后，上皮来源的MHCC97－H细胞由多边形向成纤维样细胞形态改变，由铺路石样向纺锤丝样改变。Western blot检测E－cadherin和 vimentin蛋白表达，结果显示，经TGF－β1诱导48h后，E－cadherin蛋白的表达水平明显下调（P＝0.01），vimentin蛋白分子的表达明显上调（P＝0.01，图1）。

图1 TGF－β1诱导前后细胞形态的变化（×40）及相关蛋白的表达情况Fig.1Morphological changes（×40）and the protein expression of MHCC97－H cells before and after TGF－β1treatment

2.2 FOD对MHCC97－H细胞EMT模型侵袭能力的影响 EMT模型成功建立后，Transwell小室侵袭实验检测Control组、TGF－β1组、TGF－β1＋FOD组、TGF－β1＋5－FU组及TGF－β1＋FOD＋5－FU组的侵袭能力。结果显示，TGF－β1组穿透Transwell小室的细胞数明显多于对照组（P＝0.02），药物干预后穿过Transwell小室的细胞数又显著减少（PFOD组＝0.03、P5－FU组＝0.02、P联合组＝0.01，图2）。说明FOD、5－FU处理MHCC97－H细胞EMT模型后细胞的侵袭能力减弱，而联合作用时效果更为明显。

图2 不同药物对MHCC97－H细胞侵袭能力的影响Fig.2Effects of different treatments on the invasive ability of MHCC97－H cell（40×）

2.3 Western blot检测E－cadherin、vimentin蛋白的表达 E－cadherin是典型的上皮细胞标志物，而vimentin则是间质细胞标志物。Western blot检测E－cadherin和vimentin蛋白表达，结果显示（图3），经TGF－β1诱导48h后，与正常MHCC97－H细胞相比，E－cadherin蛋白的表达水平明显受抑制（P＝0.01）；TGF－β1＋FOD组、TGF－β1＋5－FU组和TGF－β1组相比，E－cadherin蛋白的表达水平又明显回升（P＝0.03、P＝0.02），而TGF－β1＋FOD＋5－FU组E－cadherin蛋白的表达水平上调更为显著（P＝0.01）。

同时，与阴性对照组相比，TGF－β1诱导EMT组细胞vimentin蛋白的表达水平明显上升（P＝0.01）；TGF－β1＋FOD组、TGF－β1＋5－FU组和TGF－β1诱导EMT组相比，vimentin蛋白表达水平又明显回降（P＝0.04、P＝0.03），而TGF－β1＋FOD＋5－FU组vimentin蛋白的表达水平抑制较单药干预组更为明显（P＝0.01）。

图3 不同组别中E－cadherin、vimentin蛋白的表达变化Fig.3The protein expressions of E－cadherin and vimentin in different groups

3 讨论

EMT是指上皮细胞与周围间质的相互作用过程中，逐渐获得了某些间质细胞特有的性状，其主要特征是上皮细胞极性的丧失，间质特性的获得，最终导致细胞活性和侵袭性增强［5－6］。因EMT转化的许多特点和肿瘤侵袭转移极其相似，目前成为肿瘤学研究的热点［7］。

EMT是肿瘤侵袭转移过程中的关键环节，EMT的发生可受环境刺激或胞外基质因子调节。TGF－β1是新近发现的调节细胞生长与分化的TGF－β超家族的一员。在一些肿瘤模型中，如乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌，TGF－β1可诱导EMT发生，降低肿瘤细胞间的黏附并能增强侵袭力。在本实验中，我们通过TGF－β1的诱导成功建立了肝癌MHCC97－H细胞EMT模型。在细胞培养液中加入TGF－β1诱导48h后在倒置显微镜下观察细胞的形态，可见MHCC97－H发生EMT的形态改变。原本在正常培养条件下呈多角形“铺路石样”的细胞外形向长梭形“间质细胞样”转变，细胞间连接丧失，散在分布。本研究结果与相关文献报道一致，提示TGF－β1可以诱导肝癌细胞的EMT转化。

而这种形态变化可能与上皮细胞标志性蛋白E－cadherin表达减少，间质细胞标志性蛋白vimentin表达增加有关。E－cadherin表达下调可以启动细胞的EMT［8－9］，vimentin的表达增加也与EMT呈正比［10］，E－cadherin向vimentin转化可以代表肿瘤细胞的EMT进程。本实验通过Western blot检测发现，TGF－β1诱导后MHCC97－H肝癌细胞发生丢失E－cadherin并获得vimentin现象，表示细胞失去上皮表型，开始间质化，且增殖能力和迁移能力都增强。

FOD是从白花蛇舌草中提取的有效成分，具有抗炎和抗菌作用［11］，是白花蛇舌草最主要的生物活性成分，因其对多种肿瘤具有抑制作用，被视为具有极大开发前景的恶性肿瘤预防及治疗药物。

我们观察到TGF－β1诱导使肝癌细胞发生EMT的形态变化，并通过EMT标志性蛋白分子进一步证明了EMT的发生。在加入FOD、5－FU干预后，侵袭能力明显降低，同时检测到标志性蛋白分子变化发生逆转，细胞E－cadherin蛋白表达相对于EMT模型明显上调，vimentin蛋白表达则明显下调。该结果提示，FOD的抗肿瘤作用的机制可能就是通过逆转肝癌细胞EMT的发生。

总之，本研究结论提示FOD可以抑制肝癌的侵袭转移能力，此抑制作用是通过逆转肝癌细胞EMT的改变而发挥作用的。为FOD可能作为EMT抑制剂提供了理论依据和实验基础。

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Effect and mechanism of total flavones of oldenlendia diffusa willd on epithelial－mesenchymal transition of cell line MHCC97－H induced by TGF－β1

ZHANG Yan－bing1，ZHU Jiao2，XIAO Ju－xiang2，GUO Ya－huan1，LIAO Zi－jun1，XU Rui1
（1.Department of Oncology，Affiliated Shaanxi Provincial Tumor Hospital；2.Department of Oncology，the First Affiliated Hospital，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China）

Objective To investigate the effects of total flavones of oldenlandia diffusa（FOD）on epithelialmesenchymal transition in hepatocellular cancer cell line MHCC97－H.Methods TGF－β1induced EMT in routinely cultured liver cancer cell line MHCC97－H；then MHCC97－H cell was divided into 5 groups：normal control group，TGF－β1 group，TGF－β1＋FOD group，TGF－β1＋5－FU group，and TGF－β1＋FOD＋5－FU group.After 48 h of treatment，the invasion ability of MHCC97－H cell was detected by Transwell；the proteins of E－cadherin and vimentin were determined by Western blot.Results Compared with the normal form of MHCC97－H cell line，the cell had obvious long fusiform after TGF－β1 induction，and the invasion ability enhanced（P＝0.02）.But after treatment，the invasion ability of MHCC97－H cell decreased in FOD group and 5－FU group compared with that in TGF－β1 group（P＝0.03，P＝0.02），and decreased more significantly in FOD＋5－FU group（P＝0.01）.The expression of E－cadherin at the protein level decreased significantly（P＝0.01）in TGF－β1 group，which was abolished in FOD group（P＝0.03）and 5－FU group（P＝0.02）.The expression of vimentin at the protein level increased significantly（P＝0.01）in TGF－β1 group，which was abolished in FOD group（P＝0.04）and 5－FU group （P＝0.03）and more obviously in FOD＋5－FU group（P＝0.01）.ConclusionFOD can reverse the invasion of MHCC97－H cells in EMT induced by TGF－β1 through decreasing the expression of E－cadherin protein and inhibiting the epithelial－mesenchymal transition of MHCC97－H cell.

MHCC97－H cell；transforming growth factor－β1（TGF－β1）；epithelial－mesenchymal transition；total flavones of oldenlandia diffusa willd；invasion；E－cadherin；vimentin

R735.7

A

10.7652/jdyxb201602027

2015－03－23

2015－04－23

陕西省社会发展攻关计划项目（No.2013K12－07－12）Supported by Social Development Research Plan of Shaanxi Province（No.2013K12－07－12）

肖菊香.E－mail：1983181726@qq.com

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160202.1526.016.html（2016－02－02）