许建林，梁晓燕，南永刚，赵 华，施常备

（1.陕西省肿瘤医院核医学科，陕西西安 710061；2.陕西省人民医院放射科，陕西西安 710068；3.陕西省肿瘤医院头颈科，陕西西安 710061）

NIS mRNA在分化型甲状腺癌中的表达及其临床意义

许建林1，梁晓燕2，南永刚1，赵 华3，施常备1

（1.陕西省肿瘤医院核医学科，陕西西安 710061；2.陕西省人民医院放射科，陕西西安 710068；3.陕西省肿瘤医院头颈科，陕西西安 710061）

目的 观察钠碘同向转运体（sodium/iodide symporter，NIS）mRNA在分化型甲状腺癌组织中的表达，并进一步探讨其在分化型甲状腺癌诊治中的作用和价值。方法 利用实时荧光定量PCR方法观察NIS mRNA在21例结节性甲状腺肿、45例分化型甲状腺癌（包含35例甲状腺乳头状癌和10例甲状腺滤泡状癌）组织中的表达，分析NIS转录表达与甲状腺癌各临床病理参数之间的关系。结果 与良性结节性甲状腺肿相比，分化型甲状腺癌组织中NIS mRNA表达显著下降（P＜0.05）。NIS mRNA表达虽然与分化型甲状腺癌患者的年龄、性别、肿瘤大小以及组织病理学类型无关，但与颈淋巴结转移以及与肿瘤临床AJCC分期密切相关（P＜0.05）。有颈淋巴结转移组患者NIS mRNA表达量比无淋巴结转移组显著下降（P＜0.05）。此外，Ⅲ～Ⅳ期肿瘤患者癌组织NIS mRNA表达量比Ⅰ～Ⅱ期显著下降（P＜0.05）。结论 NIS表达差异可以为分化型甲状腺癌个性化放射性碘治疗提供依据。

分化型甲状腺癌；钠碘同向转运体（NIS）；放射性碘治疗；实时荧光定量PCR

甲状腺癌（thyroid carcinoma，TC）是目前最常见的头颈部恶性肿瘤之一，也是最常见的内分泌肿瘤之一［1－2］。近年来我国乃至世界TC的发病呈明显上升和年轻化的趋势［1－4］。分化型甲状腺癌（differentiated thyroid carcinoma，DTC）包括乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）、滤泡状癌（follicular thyroid carcinoma，FTC）和嗜酸性细胞癌（Hürthle cell cancer），是TC中发病率最高的肿瘤，约占所有TC 的95％左右［4－5］。DTC总体预后较为良好，病程进展相对缓慢，恶性程度相对较低。研究表明，手术、131碘和甲状腺素制剂替代治疗后，虽然大多数DTC患者预后良好，但仍有约30％DTC患者复发和转移，而且转移患者的2/3出现病灶对131碘抵抗［6］，但其具体原因与机制尚不明确。

钠/碘同向转运体（sodium/iodide symporter，NIS）是甲状腺滤泡细胞基底膜上的一种跨膜糖蛋白［1，5，7－8］，人类hNIS基因位于19号染色体短臂上，由643个氨基酸组成，NIS能选择性、主动性地转运血液中的碘进入滤泡上皮细胞，碘化甲状腺球蛋白上的酪氨酸残基，通过溶酶体的作用分解成甲状腺激素，并以囊泡的形式将甲状腺激素释放到血液中［7－9］。NIS对于活性碘的转运不仅是生理合成甲状腺激素的重要限速步骤，同时也是临床上利用放射性碘的方法来评价、诊断和治疗甲状腺疾病的基础［9－10］。然而，目前关于NIS在DTC肿瘤组织中的表达情况尚存在争议［1，4－5，11－12］，并且当前的研究大多数都是针对NIS蛋白的研究，关于NIS转录水平的研究非常有限。因此，本研究采用实时荧光定量PCR方法检测NIS mRNA在人类DTC组织中的表达情况，通过分析NIS表达与TC临床病理参数之间的相互关系，探讨NIS在DTC诊断以及放射性碘治疗中的意义和价值。

1 材料与方法

1.1 标本来源与采集 收集陕西省肿瘤医院2012 年1月至2013年12月间临床资料完整的结节性甲状腺肿和DTC患者，本次共收集结节性甲状腺肿21例（其中男性6例，女性15例），年龄（45.57±13.11）岁。DTC共45例（其中男性8例，女性37例）；年龄（51.91±12.59）岁；其中乳头状癌35例，滤泡性癌10例；颈淋巴结转移15例；根据美国癌症联合会（AJCC）拟定的最新DTC分期标准，AJCC肿瘤分期Ⅰ期20例，Ⅱ期9例，Ⅲ期10例，Ⅳ期6例。所有病例术前均未进行放疗、化疗以及服用甲状腺素类药物等治疗。采集手术标本，取材前征得患者同意并签订知情同意书，所有标本均用RNA酶抑制剂处理过的锡箔纸包裹，并于取材后立即记录，标记并置入液氮内冷冻保存。

1.2 主要试剂 SYBR Green荧光染料试剂盒［TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司］，Trizol试剂、RT试剂盒（美国的Promega公司），PCR引物（上海生工生物工程技术公司合成）等。

1.3 组织总RNA提取 首先利用Trizol法提取组织总RNA，具体过程为：在100mg液氮冰冻组织中加入Trizol 1mL，匀浆后加入0.2mL氯仿混匀，离心后吸取上清，加入0.5mL异丙醇，离心沉淀后弃上清，700mL/L乙醇洗沉淀，DNaseⅠ酶解可能残余的基因组DNA。利用10g/L琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度仪检测提取的总RNA质量和浓度。余RNA经冻干机冻干20～30min，完全变为干粉状后，置于－80℃冷冻保存。

1.4 逆转录制备模板cDNA 反应体系20μL：在装盛RNA干粉的EP管中加入DEPC水30μL充分溶解，从中取11μL溶解液置于另一新EP管中，加入5×反应缓冲液4μL，随机引物1μL，RNA酶抑制剂1μL，M－MLV逆转录酶1μL，10mmol/L dN TP混合物2μL。扩增条件：20℃10min，42℃60min，70℃5min。冰浴冷却，－20℃保存备用。

1.5 实时荧光定量PCR 以cDNA为模板进行PCR扩增。根据文献［13］设计RCR引物。NIS上游引物：5′－GTCGTGGTGATGCTAAGTG－3′，下游引物：5′－CTCGGGTCAGGGTTAAAG－3′，RCR扩增片段长度134bp。内参β－actin上游引物：5′－TTATCTTAGTGCCTCTGTATGTC－3′，下游引物：5′－TTTTGATCTTTCTGGTGG－3′，RCR扩增片段长度146bp。引物均由上海生工有限公司合成。实时荧光定量使用TaKaRa公司SYBR premix Ex TaqTM（perfect real time）试剂盒进行检测，在ABI PRISM7500Real－time PCR System中进行。PCR反应体系为25μL，其中cDNA模板1μL，SYBR Premix Ex TaqTM（2×）12.5μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，双蒸水10μL。PCR反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，进行40个循环。在每个循环退火末检测荧光信号，进行实时监控。收集数据，测定各样品的Ct （cycle threshold，扩增拷贝数）值，与标准曲线进行比较，得出待测样品的拷贝数。为了消除样本、逆转录和PCR反应的差异，NIS mRNA的表达量采用各标本定量的Ct值与相同标本的内参照基因定量的Ct值之比来表示。同时，在PCR反应过程中，设定无cDNA样品的空白管作为阴性对照。

1.6 统计学处理 所有数据均采用SPSS17.0统计学软件进行统计分析。实验数据以均数±标准差来表示，组间比较采用One－way方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结节性甲状腺肿和DTC组织总RNA提取 结节性甲状腺肿和DTC组织提取的总RNA经10g/L琼脂糖凝胶电泳，均可见28S、18S和5S三条带，无DNA污染条带及明显降解条带，表明各组织均提取到总RNA，紫外分光光度计检测RNA纯度，比值为A260/A280＞1.8，表明RNA纯度较高。

2.2 NIS mRNA在不同类型甲状腺病变组织中的表达情况 结节性甲状腺肿组织中NIS mRNA的表达量为0.71±0.08，而DTC组织中NIS mRNA表达量为0.45±0.12。与结节性甲状腺肿相比，DTC组织NIS mRNA水平的表达量显著下降（P＜0.01，表1）。

表1 NIS mRNA在结节性甲状腺肿与DTC组织中表达的比较Tab.1 Comparison of NIS mRNA expression in nodular goiter and differentiated thyroid carcinoma

2.3 NIS mRNA在DTC组织中的表达及其与临床病理参数之间的关系 NIS mRNA表达与DTC临床病理参数之间的关系见表2。由表可见，NIS mRNA表达与患者年龄、性别，肿瘤大小无关（P＞0.05）；此外，NIS mRNA表达与肿瘤组织学类型也无关，也就是说乳头状癌与滤泡状癌之间NIS mRNA表达未见明显统计学差异（P＞0.05）。

但是，NIS mRNA表达与颈淋巴结转移密切相关（P＜0.05）。有颈淋巴结转移组肿瘤组织NIS mRNA表达量（0.39±0.12）与无淋巴结转移组肿瘤组织NIS mRNA表达量（0.48±0.10）相比显著下降（P＜0.05）。

此外，NIS mRNA表达与肿瘤临床AJCC分期密切相关（P＜0.05）。AJCCⅢ－Ⅳ期患者肿瘤组织NIS mRNA表达量（0.49±0.11）与AJCCⅠ～Ⅱ期患者肿瘤组织NIS mRNA表达量（0.40±0.12）相比显著下降（P＜0.05）。

3 讨论

TC是最常见的内分泌系统恶性肿瘤，占所有人类恶性肿瘤的1.6％［1－4］。2011年美国确诊甲状腺新发肿瘤病例48 020例，占内分泌肿瘤的95.3％，占所有新发肿瘤的3％左右［3］。我国研究也显示TC以每年6.2％的速率不断增长［14］。在TC发病患者中，约95％的患者均属于DTC［4－5］。目前，在DTC的治疗中，主要采取包括手术、放射碘治疗、抑制TSH在内的综合治疗方式，虽然有较好的治疗效果，但仍然具有较高的复发率［6，15］。此外，也有研究报道显示有部分DTC在治疗或自然病程过程TSH受体表达降低和浓聚碘的能力丧失，使放射性碘治疗和甲状腺素抑制TSH治疗难以奏效，即放射性碘难治性癌［16］，但目前其中具体的分子机制尚不清楚。

表2 NIS mRNA的表达与DTC的临床病理指标间的关系Tab.2 Relationship between the expression of NIS mRNA and the clinicopathological parameters of differentiated thyroid carcinoma

NIS是一种分布在甲状腺组织滤泡细胞基底膜上的糖化膜蛋白，其功能是作为“碘泵”，借助钠/钾交换而产生的细胞内外钠浓度梯度来转运血液内的碘进入滤泡细胞，参与甲状腺激素合成［7－9］。NIS所具有的聚碘功能是甲状腺核素显像的重要基础，同时它也是放射性碘治疗TC的理论基础。然而当前针对NIS在DTC中的定量的报道相对较少。鉴于此，本研究通过实时荧光定量PCR方法对NIS在DTC中的表达进行分析，旨在为患者的放射碘个性化治疗提供依据，并从分子角度探索TC碘抵抗的机制。

本实验显示，在结节性甲状腺肿组织中NIS mRNA的表达量为0.71±0.08，而DTC组织中NIS mRNA表达量为0.45±0.12。与结节性甲状腺肿相比，DTC组织NIS mRNA水平的表达量显著下降。这一研究结果与帅红霞、王志峰等［12－13］的报道相似。相比正常甲状腺组织以及良性甲状腺病变组织，TC 中NIS表达减弱，表明其摄碘能力降低，这也许可以解释为什么临床上对DTC转移灶进行放射性碘治疗前必须做甲状腺全切及“清甲”治疗［17］。从另一方面来看，本研究表明NIS mRNA定量值也许可以作为判断良恶性甲状腺疾病的参考指标。

此外，本研究首次探讨了NIS mRNA表达水平与TC临床病理参数之间的关系，结果显示NIS mRNA表达与患者年龄、性别、肿瘤大小以及肿瘤组织学类型无关，但NIS mRNA表达与颈淋巴结转移以及肿瘤临床AJCC分期密切相关。这些结果可能表明NIS表达量低的TC更有可能发生淋巴结转移以及远处转移，NIS可能参与调控TC的浸润转移过程。因此，NIS可能具有一定的预测TC转移以及判断TC预后的指标。

另一方面，我们关于NIS差异化表达的研究结果也可以进一步解释为什么TC伴发转移患者中有大约2/3的病例会出现对131碘治疗的抵抗。分析其原因可能是伴发转移的TC组织NIS表达降低，从而使得肿瘤组织的摄碘能力下降，从而进一步出现放射性碘治疗抵抗。因此针对放射性碘抵抗的患者，如果对NIS基因转染失分化的和NIS低表达的TC细胞株进行分子基因转染，增加肿瘤细胞NIS表达，从而增强其摄取碘的能力，也可能为DTC提供一项新的分子治疗手段。

综上所述，我们的研究结果证实了NIS mRNA 在DTC组织中的差异化表达，NIS转录表达与颈淋巴结转移以及肿瘤临床AJCC分期密切相关。NIS表达差异可能决定了放射碘治疗的临床效果和敏感性。通过对其NIS的表达进行定量分析，可为DTC个性化放射性碘治疗提供可靠的实验依据和指导，帮助提高131碘核素内照射治疗的疗效和敏感性。

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（编辑 韩维栋）

Expression of sodium iodide symporter mRNA and its clinical significance in differentiated thyroid carcinoma

XU Jian－lin1，LIANG Xiao－yan2，NAN Yong－gang1，ZHAO Hua3，SHI Chang－bei1
（1.Department of Nuclear Medicine，Shaanxi Provincial Tumor Hospital，Xi’an 710061；2.Department of Radiology，Shaanxi Provincial People’s Hospital，Xi’an 710068；3.Department of Head and Neck，Shaanxi Provincial Tumor Hospital，Xi’an 710061，China）

Objective To investigate the expression of sodium iodide symporter（NIS）mRNA in differentiated thyroid Carcinoma（DTC）and further explore its value in clinical diagnosis and therapy of DTC.Methods The expression of NIS mRNA was detected and analyzed in 21 nodular goiter and 45 cases of DTC （including 35 cases of papillary thyroid carcinoma and 10 cases of follicular thyroid carcinoma）by using real－time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction（real－time RT－PCR）.Results Compared with that in nodular goiter，the mRNA expression of NIS in DTC tissue was significantly decreased（P＜0.05）.Moreover，the mRNA expression of NIS was significantly correlated with lymph node metastasis and AJCC stage，respectively.The expression of NIS mRNA in DTC with lymph node metastasis was significantly decreased compared with that in DTC without lymph node metastasis（P＜0.05）.In addition，the expression of NIS mRNA inⅡ－Ⅳstage DTC was significantly decreased compared with that inⅠ－Ⅱstage DTC（P＜0.05）.Conclusion Differential expression of NIS can provide evidence for individual131I therapy for DTC.

differentiated thyroid carcinoma（DTC）；sodium iodide symporter（NIS）；OPN；131I therapy；real－time RT－PCR

R736.1

A

10.7652/jdyxb201602023

2015－02－06

2015－06－24

陕西省科学技术研究发展计划项目（No.2014K11－01－02－16）Supported by the Science and Technology Project of Shaanxi Province（No.2014K11－01－02－16）

许建林.E－mail：xujianlin1973@126.com

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160124.1221.002.html（2016－01－24）