谢小娟，潘晶晶，魏力强，陈 葳

（1.陕西省临床检验中心，陕西西安 710068；2.西安交通大学第一附属医院检验科，陕西西安 710061）

miR－199a－3p靶基因预测及生物信息学分析

谢小娟1，2，潘晶晶2，魏力强1，陈 葳2

（1.陕西省临床检验中心，陕西西安 710068；2.西安交通大学第一附属医院检验科，陕西西安 710061）

目的 为深入研究miR－199a－3p在膀胱癌形成和发展中的作用提供理论依据。方法 分析miR－199a－3p序列，预测其靶基因和转录因子，并对靶基因进行GO富集和KEGG Pathway分析；构建TF－miR－199a－3p－靶基因网络调控图。结果 miR－199a－3p序列在多物种间具有高度保守性；GO分析发现miR－199a－3p的靶基因参与细胞调节、代谢调节、细胞大分子生物合成等生物过程（P＜0.01）；KEGG Pathway分析发现miR－199a－3p的靶基因显著富集在上皮细胞的细菌入侵通路、ECM受体的相互作用通路、PI3K－Akt信号通路、MAPK信号通路、小细胞肺癌通路、癌症中的蛋白聚糖通路等；根据构建的TF－miR－199a－3p－靶基因网络调控图，挖掘出可能受miR－199a－3p调控的重要基因有MYC、SP1、mTOR、NFκB、NFκB1等。结论 miR－199a－3p可能通过直接靶向作用mTOR，调节PI3K－Akt－mTOR信号通路，从而参与膀胱癌的形成和发展。

miR－199a－3p；生物信息学；mTOR；GO富集分析；KEGG Pathway分析；膀胱癌；PI3K－Akt；MAPK；蛋白聚糖

miRNA是高度保守的非蛋白编码的小RNA，长度约22nt。成熟的miRNA通过介导目的基因沉默，使靶miRNA降解，从而调控转录后基因表达水平［1］。miRNA几乎参与了所有生命活动过程的调节，并且在肿瘤的发生、发展中起重要作用。多项研究表明许多miRNA参与膀胱癌的进展，文献报道miR－199a－3p在膀胱癌中表达下调。本研究运用生物信息学分析，预测miR－199a－3p的转录因子和靶基因，并对其靶基因进行GO（gene ontology）富集和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome）Pathway分析，为miR－199a－3p在膀胱癌进展中的功能研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 miR－199a－3p的同源性分析 采用miRBase （http://mirbase.org/index.shtml）在线检索各物种的miR－199a－3p序列，进行同源性分析。

1.2 miR－199a－3p的靶基因预测 采用miRanda（http://www.microrna.org/）、Clip－Seq（http://mirtarclip.mbc.nctu.edu.tw/）、TargetScan（http://www.targetscan.org/）和miRDB（http://www.mirdb.org/）4个在线数据库预测miR－199a－3p的靶基因。

1.3 miR－199a－3p预测靶基因的GO分析 将2个在线数据库均预测到的miR－199a－3p的靶基因，进行GO富集分析。通过物种和基因信息，用Gene Ontology数据库查找基因的GO注释信息。根据基因的GO注释，选择本物种的所有基因作为背景基因，以P＜0.01为显著性阈值得到的GO高频率注释相对于背景具有统计意义。Gene Ontology包括细胞组件（cellular component）、分子功能（molecular function）、生物过程（biological process）3部分。

1.4 miR－199a－3p预测靶基因的KEGG Pathway分析 将2个在线数据库均预测到的miR－199a－3p的靶基因，采用生物学通路数据库（http://www.genome.jp/kegg/）在线预测KEGG Pathway。采用DAVID数据库中软件附带的Fisher Exact Test计算KEGG Pathway的P值，以P＜0.05为显著性阈值得到基因集合的信号通路相对于背景具有统计学意义。

1.5 miR－199a－3p转录因子的预测 通过miRBase （http://mirbase.org/index.shtml）数据库以及UCSC（http://genome.ucsc.edu/index.html）数据库找出miRNA前体的位置。为了保证结果的代表性，取其前体上游的5 000bp基因序列进行分析。在JASPAR（http://jaspar.binf.ku.dk/）数据库中输入前体的序列并选择相应的参数进行搜索，得出转录因子（transcription factor，TF）的位置与名称。miR－199a－3p与TF结合可能性评分越接近100，可能性越大。

1.6 TF－miRNA－mRNA调控网络图的构建 综合各种蛋白互作（相互作用）数据库，对靶基因总集建立起蛋白互作关系；合并TF和miR－199a－3p调节关系、miR－199a－3p和mRNA靶向关系、靶基因总集的蛋白互作关系，从而得到miR－199a－3p的TF－miRNA－mRNA网络调控图。

2 结果

2.1 miR－199a－3p的同源性分析 应用miRBase数据库在线检索，发现人（has）miR－199a－3p基因序列号为MIMAT0000232，其前体70个碱基定位于19号染色体10817426～10817496位。通过miRBase对小鼠（mmu）、热带爪蟾（xtr）、牛（bta）、大鼠（rno）、猕猴（mml）、黑猩猩（ptr）等20个物种的miR－199a－3p序列比对分析，发现has－miR－199a－3p的成熟序列“ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA”在各物种间高度保守（表1）。

表1 各物种miR－199a－3p的成熟序列Tab.1 Mature sequence of miR－199a－3p in various species

2.2 miR－199a－3p的靶基因预测 miRanda、Clip－Sep、TargetScan、miRDB 4个在线数据库预测miR－199a－3p的靶基因个数分别是0、221、404、296。其中2个数据库预测的相同靶基因177个，3个数据库预测的相同靶基因26个（图1）。

2.3 miR－199a－3p预测靶基因的GO分析 将2个数据库都预测到的177个miR－199a－3p的靶基因作GO分析，发现miR－199a－3p的靶基因富集在细胞膜、细胞质、细胞核等13个细胞组件（P＜0.01），参与磷蛋白结合、受体信号蛋白活性、转录抑制物活性等25个分子功能（P＜0.01），涉及细胞调节、代谢过程调节、细胞大分子生物合成、基因表达等134个生物过程（P＜0.01，表2）。

2.4 miR－199a－3p预测靶基因的KEGG Pathway分析 将2个数据库都预测到的177个miR－199a－3p的靶基因作KEGG Pathway分析，发现miR－199a－3p的靶基因显著富集在上皮细胞的细菌入侵通路、ECM受体的相互作用通路、PI3K－Akt信号通路、MAPK信号通路、细胞内吞作用通路、小细胞肺癌通路、癌症中的蛋白聚糖通路等（P＜0.05，表3）。miR－199a－3p的靶基因参与PI3K－Akt信号通路（图2）。

图1 miR－199a－3p的预测靶基因个数Fig.1Prediction number of target genes of miR－199a－3p

2.5 miR－199a－3p的转录因子预测 预测到miR－199a－3p的转录因子304个，结合评分＞80的结合位点627个，其中126个位点＞90分，13个位点为100分（表4）。

2.6 TF－miRNA－mRNA调控网络图的构建 根据miR－199a－3p预测的TF、靶基因、靶基因编码的蛋白构建调控网络图（图3）。对网络图里面的互作关系进行统计，从而挖掘出可能调控miR－199a－3p的转录因子有AP1、FOS、ESR1、BRCA1、CREB1等；可能受miR－199a－3p调控的基因有MYC、SP1、mTOR、NFκB、NFκB1等（图4）。

表2 miR－199a－3p预测靶基因的GO功能分析结果Tab.2 Gene ontology of prediction of miR－199a－3p

表3 miR－199a－3p预测靶基因的KEGG Pathway分析Tab.3 KEGG Pathway of prediction of miR－199a－3p

图2 miR－199a－3p的预测靶基因参与PI3K－Akt信号通路Fig.2Predicted target genes of miR－199a－3p participated in PI3K－Akt signal pathway

3 讨论

miR－199a－3p定位于19号染色体10817426－ 10817496位，位于DNM2基因16号内含子，在多种肿瘤组织和细胞中均有差异表达。DUAN［2］、TIAN等［3］研究表明，miR－199a－3p在骨肉瘤中低表达，通过靶向调节mTOR、Met、Stat3、AXL等基因，抑制骨肉瘤细胞的侵袭和转移；FORNARI等［4］研究发现miR－199a－3p通过调节mTOR、c－Met影响肝癌细胞对阿霉素的敏感性；HENRY等［5］发现miR－199a－3p靶向CD44分子，减少肝癌细胞的增殖；KINOSE等［6］研究发现miR－199a－3p与缺氧相关，通过下调c－Met的表达抑制卵巢癌细胞侵袭；HAN等［7］报道miR－199a－3p作为抑癌基因，通过靶向NLK，抑制结直肠癌；MINNA等［8］研究发现miR－199a－3p抑制乳头状甲状腺癌；但SONG等［9］报道miR－199a－3p在胃癌组织表达上调，促进胃癌细胞增殖和转移；WANG等［10］进一步研究证实miR－199a－3p通过靶向ZHX1，促进胃癌进展；RATERT［11］、ICHIMI等［12］报道miR－199a－3p在膀胱癌组织中表达下调，其具体的作用机制还有待进一步研究。

表4 miR－199a－3p的预测转录因子及结合位点Tab.4 Prediction of TF and binding site of miR－199a－3p

图3 TF－miR－199a－3p－靶基因调控网络图Fig.3Regulation network diagram of TF－miR－199a－3p－target genes

图4 预测的miR－199a－3p转录因子和靶基因重要性排序Fig.4Theimportance order of TF and target genes of miR－199a－3p

本课题采用4个在线软件预测miR－199a－3p的靶基因，取2个软件都预测到的相同靶基因进行GO富集和KEGG Pathway分析。GO分析发现，miR－199a－3p的靶基因富集在细胞膜、细胞质、细胞核等细胞组件，参与磷蛋白结合、受体信号蛋白活性、转录抑制物活性等分子功能，涉及细胞调节、代谢过程调节、细胞大分子生物合成、基因表达等生物过程。KEGG Pathway分析，发现miR－199a－3p的靶基因显著富集在上皮细胞的细菌入侵通路、ECM受体的相互作用通路、PI3K－Akt信号通路、MAPK信号通路、细胞内吞作用通路、小细胞肺癌通路、癌症中的蛋白聚糖通路等。这些预测的靶基因参与的信号通路及生物学过程涉及肿瘤细胞分化和代谢等方面，提示miR－199a－3p可能作为一个抑癌基因，参与肿瘤形成及进展。根据TF－miR－199a－3p－靶基因调控网络图，挖掘出可能受miR－199a－3p调控的重要基因有mTOR、NFκB、NFκB1、CREB1、CD42等。

文献报道mTOR是miR－199a－3p的靶基因之一［2，4］。mTOR（即哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）是一种跟PI3K－Akt通路相关的蛋白激酶，通过磷酸化激活与mRNA翻释相关的蛋白p70S6K等增强mRNA的转录和翻译，也能磷酸化灭活翻译抑制蛋白4EBP1等。Akt通过磷酸化mTOR的Ser2448位点而激活mTOR，提高mRNA翻译的效率，增加细胞生长和分化相关蛋白的表达，促进肿瘤发生［13］。PI3KAkt－mTOR信号转导通路激活可以抑制细胞凋亡，促进细胞增殖，在肿瘤的形成、发展、侵袭和转移中发挥重要作用。近年来，对PI3K－Akt－mTOR信号通路的研究发现，此通路控制着众多肿瘤发生发展中至关重要的细胞生物学过程。因此，抑制该通路成为肿瘤预防和靶向治疗的焦点。

膀胱癌是最常见的泌尿系统恶性肿瘤，全球发病率呈上升趋势。我国膀胱癌发病率低于西方国家，但近些年的发病率有增高的趋势，严重威胁着患者的健康。研究表明，PI3K－Akt－mTOR信号转导通路在膀胱癌的发生发展中起着重要作用。CHEN等［14－15］研究发现，PI3K－Akt－mTOR信号通路的遗传变异，可增加膀胱癌的发病风险，并可以预测肌侵袭性和转移性膀胱癌；SUN等［16］进一步研究证实激活PI3KAkt－mTOR信号通路，可促进膀胱上皮癌侵袭，降低患者生存率；SANGUEDOLCE等［17］进一步研究证实PI3K－Akt－mTOR不仅有预测膀胱癌发生的作用，更是膀胱癌治疗的靶点；QIAN等［18］证实mTOR在膀胱癌中高表达，其抑制物对治疗膀胱癌有益。本研究发现miR－199a－3p的靶基因富集于PI3K－Akt信号通路，mTOR是其靶基因之一，提示miR－199a－3p可能通过直接靶向作用mTOR，调节PI3K－AktmTOR信号通路，从而参与膀胱癌的形成和进展。

［1］CISSELL KA，DEO SK.Trends in microRNA detection［J］.Anal Bioanal Chem，2009，394（4）：1109－1016.

［2］DUAN Z，CHOY E，HARMON D，et al.MicroRNA－199a－3p is downregulated in human osteosarcoma and regulates cell proliferation and migration［J］.Mol Cancer Ther，2011，10（8）：1337－1345.

［3］TIAN R，XIE X，HAN J，et al.miR－199a－3p negatively regulates the progression of osteosarcoma through targeting AXL ［J］.Am J Cancer Res，2014，4（6）：738－750.

［4］FORNARI F，MILAZZO M，CHIECO P，et al.MiR－199a－3p regulates mTOR and c－Met to influence the doxorubicin sensitivity of human hepatocarcinoma cells［J］.Cancer Res，2010，70（12）：5184－5193.

［5］HENRY JC，PARK JK，JIANG J，et al.miR－199a－3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，403（1）：120－125.

［6］KINOSE Y，SAWADA K，NAKAMURA K，et al.The hypoxia－related microRNA miR－199a－3p displays tumor suppressor functions in ovarian carcinoma［J］.Oncotarget，2015，6（13）：11342－11356.

［7］HAN Y，KUANG Y，XUE X，et al.NLK，a novel target of miR－199a－3p，functions as a tumor suppressor in colorectal cancer［J］.Biomed Pharmacother，2014，68（5）：497－505.

［8］MINNA E，ROMEO P，DE CECCO L，et al.miR－199a－3p displays tumor suppressor functions in papillary thyroid carcinoma ［J］.Oncotarget，2014，5（9）：2513－2528.

［9］SONG G，ZENG H，LI J，et al.miR－199a regulates the tumor suppressor mitogen－activated protein kinase kinase kinase 11 in gastric cancer［J］.Biol Pharm Bull，2010，33（11）：1822－1827.

［10］WANG Z，MA X，CAI Q，et al.MiR－199a－3p promotes gastric cancer progression by targeting ZHX1［J］.FEBS Lett，2014，588（23）：4504－4512.

［11］RATERT N，MEYER HA，JUNG M，et al.miRNA profiling identifies candidate mirnas for bladder cancer diagnosis and clinical outcome［J］.J Mol Diagn，2013，15（5）：695－705.

［12］ICHIMI T，ENOKIDA H，OKUNO Y，et al.Identification of novel microRNA targets based on microRNA signatures in bladder cancer［J］.Int J Cancer，2009，125（2）：345－352.

［13］乐堃，曾宇慧.PI3K/Akt/mTOR信号传导通路与泌尿系统肿瘤［J］.国际内科学杂志，2007，34（9）：509－512.

［14］CHEN M，CASSIDY A，GU J，et al.Genetic variations in PI3K－Akt－mTOR pathway and bladder cancer risk［J］.Carcinogenesis，2009，30（12）：2047－2052.

［15］CHEN M，GU J，DELCLOS GL，et al.Genetic variations of the PI3K－Akt－mTOR pathway and clinical outcome in muscle invasive and metastatic bladder cancer patients［J］.Carcinogenesis，2010，31（8）：1387－1391.

［16］SUN CH，CHANG YH，PAN CC.Activation of the PI3K/Akt/mTOR pathway correlates with tumour progression and reduced survival in patients with urothelial carcinoma of the urinary bladder［J］.Histopathology，2011，58（7）：1054－1063.

［17］SANGUEDOLCE F，CORMIO A，BUFO P，et al.Molecular markers in bladder cancer：Novel research frontiers［J］.Crit Rev Clin Lab Sci，2015，8：1－14.

［18］QIAN CN，FURGE KA，KNOL J，et al.Activation of the PI3K/AKT pathway induces urothelial carcinoma of the renal pelvis：identification in human tumors and confirmation in animal models［J］.Cancer Res，2009，69（21）：8256－8264.

（编辑 国 荣）

Prediction of miR－199a－3p targets gene and its bioinformatics analysis

XIE Xiao－juan1，2，PAN Jing－jing2，WEI Li－qiang1，CHEN Wei2
（1.Shaanxi Center for Clinical Laboratory，Xi’an 710068；2.Department of Clinical Laboratory，the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China）

Objective To provide theoretical guidance for further research on the role of miR－199a－3p in formation and development of bladder cancer.Methods Mature sequence of miR－199a－3p was analyzed；target genes and transcription factors of miRNA－199a－3p were predicted，and the target genes were analyzed for gene ontology（GO）enrichment and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome（KEGG）pathway.Then TF－miRNA－mRNA network diagram was constructed.Results Sequences of miR－199a－3p were highly conserved in various species.In GO analysis，the target genes of miR－199a－3p were enriched in many biological processes，such as regulation of cellular process，regulation of macromolecule metabolic process，and regulation of biological process （P＜0.01）.In KEGG pathway，the target genes were mainly located in bacterial invasion pathway of epithelial cells，ECM－receptor interaction pathway，PI3K－Akt signaling pathway，MAPK signaling pathway，small cell lung cancer pathway，and proteoglycans pathway in the cancer（P＜0.05）.According to the TF－miRNA－mRNA network diagram，the important genes that might be regulated by miR－199a－3p were MYC，SP1，mTOR，NFκB，and NFκB1.Conclusion miR－199a－3p may directly target mTOR and participate in the formation and development of bladder cancer through regulating PI3K－Akt－mTOR signaling pathway.

miR－199a－3p；bioinformatics；mammalian target of rapamycin（mTOR）；gene ontology（GO）enrichment analysis；Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome（KEGG）pathway analysis；bladder cancer；PI3KAkt；MAPK；proteoglycan

Q74；R737.14

A

10.7652/jdyxb201602020

2015－07－06

2015－10－09

陈葳.E－mail：chenwei808@mail.xjtu.edu.cn

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160202.1247.008.html（2016－02－02）