赵 鑫，施晓雷，马虎成，丁义涛

（南京大学医学院附属鼓楼医院肝胆外科，江苏南京 210008）

抗中性粒细胞血清对D－氨基半乳糖诱导的急性肝衰竭大鼠的作用

赵 鑫，施晓雷，马虎成，丁义涛

（南京大学医学院附属鼓楼医院肝胆外科，江苏南京 210008）

目的 研究D－氨基半乳糖（D－GalN）诱导的急性肝衰竭大鼠中性粒细胞的改变，探讨以中性粒细胞为靶点的干预手段对急性肝衰竭的治疗作用。方法 构建D－GalN诱导的SD大鼠急性肝衰竭模型，观察造模后大鼠肝功能、炎性因子（TNF－α、IL－1β）及外周血与肝脏中性粒细胞水平随时间的变化。为观察中性粒细胞的治疗作用，将SD大鼠随机分为3组：对照组、肝衰组及治疗组（造模前24h尾静脉注射抗中性粒细胞血清）。生化及血液分析仪检测肝脏生化指标（ALT、AST、TBIL、BA）及外周血中性粒细胞的数量及比率；免疫组化染色和Tunel染色分别检测肝脏中性粒细胞数量及肝细胞凋亡水平；RT－PCR检测肝脏组织炎性因子mRNA水平。结果 D－GalN诱导SD大鼠急性肝衰竭后6h血清ALT、AST、TBIL及BA较造模前显著升高（P＜0.05）；肝脏组织中TNF－α、IL－1β的mRNA表达水平在造模后6h达到峰值（P＜0.001），24h仍明显高于造模前水平（P＜0.001）；外周血中性粒细胞数量、比率在造模后12h显著增多（P＜0.001），并至少持续至24h（P＜0.001）。造模前24h尾静脉注射抗中性粒细胞血清后，大鼠外周血及肝脏中性粒细胞数量在造模后24h较肝衰组明显降低（P＜0.001）；同时，血清ALT、AST、TBIL及BA较肝衰组显著下降（P＜0.05），肝脏组织凋亡细胞显著减少，肝脏TNF－α、IL－1β表达水平也在治疗后明显下降（P＜0.05）。结论D－GalN诱导的急性肝衰竭大鼠可出现外周血及肝脏中性粒细胞聚集，抗中性粒细胞血清可有效改善急性肝衰竭大鼠的肝功能及肝脏免疫微环境。

D－氨基半乳糖；急性肝衰竭；中性粒细胞；免疫微环境

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160202.1115.004.html（2016－02－02）ABSTRACT：Objective To investigate changes in the neutrophils in rats with D－galactosamine（D－GalN）－induced acute liver failure（ALF）and to explore the therapeutic effect of interventions treatment of neutrophils on ALF.Methods Liver function，the expressions of inflammatory cytokines TNF－αand IL－1β，and the changes of neutrophils in the peripheral blood and the liver were observed in rats with D－GalN（intraperitoneal injection）－induced ALF.SD rats were randomly divided into three groups when treated with intervention of neutrophils：control group，ALF group（intraperitoneal injection of D－GalN），and treatment group（intravenous injection of anti－PMN serum via tail vein 24 h before modeling）.Biochemical analysis was used to detect serum ALT，AST，TBIL and blood ammonia.Hematology analyzer was applied to analyze the number and percentage of peripheral blood neutrophils.The number of neutrophils in the liver was evaluated by immunohistochemistry.Liver RT－PCR was adopted to detect the mRNA expression of inflammatory cytokines TNF－αand IL－1β.Results We found that 6 h after D－GalN injection，serum ALT，AST，TBIL and blood ammonia in ALF rats were significantly increased （P＜0.05）.The mRNA expression levels of inflammatory cytokines TNF－αand IL－1βin the liver reached the peak

急性肝功能衰竭（acute liver failure，ALF）是在没有基础肝脏疾病状态下快速发生的肝细胞功能障碍，由于蛋白合成受损、凝血功能障碍、肝性脑病等多种严重并发症的影响，目前除肝移植外尚缺乏有效的治疗手段［1］。肝脏组织免疫微环境的失衡被认为是ALF的重要发病机制，免疫调节相关的细胞及炎性因子在其中的作用亦得到大量研究的关注［2］。中性粒细胞在肝脏免疫微环境平衡中占有重要地位，在酒精性肝病、缺血再灌注损伤及内毒素血症所致的肝细胞损害中均可观察到中性粒细胞的诱导作用［3－5］。中性粒细胞在急性肝功能衰竭状态下可被募集至肝脏细胞，并出现“免疫麻痹”现象，进而对肝组织及肝外组织形成直接损伤。研究认为，这一过程可能伴随着中性粒细胞介导的活性氧增多与肝窦区蛋白酶的聚集和激活［6］，但其相关机制尚未有深入探讨。基于其在肝脏免疫调控中的重要作用，本研究将观察D－氨基半乳糖（D－galactosamine，D－GalN）诱导的SD大鼠ALF模型下中性粒细胞的状态与功能改变，并通过外源性给予抗中性粒细胞血清探讨其对ALF的肝脏功能及免疫微环境的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康雄性SD大鼠，无特定病原体级，体质量（200±20）g，由南京大学医学院附属鼓楼医院实验动物中心提供。56只SD大鼠禁食12h后，以800mg/kg浓度腹腔注射由等渗生理盐水稀释的D－GalN诱导急性肝衰竭模型，分别于造模后0、6、12、24、72、120、168h处死大鼠，收集大鼠外周血及肝脏组织待测。另将27只SD大鼠随机分为3组：对照组、肝衰竭、治疗组。对照组：在相应造模时间腹腔注射等量等渗生理盐水；肝衰组：实验动物予禁食12h后，以800mg/kg浓度腹腔注射由等渗生理盐水稀释的D－GalN；治疗组：建立急性肝衰竭模型前24h经大鼠尾静脉注射0.8mL兔抗大鼠中性粒细胞血清。在诱导急性肝衰竭模型24h后处死大鼠，收集大鼠外周血及肝脏组织待测。

1.2 主要试剂 D－氨基半乳糖购自南京博源医药科技有限公司，兔抗大鼠中性粒细胞血清购自加拿大Cedarlane公司，Tunel试剂盒及MPO抗体购自美国Gibco公司，RNA提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，RT－PCR相关试剂盒购自日本TaKa－Ra Bio公司。

1.3 主要检测手段

1.3.1 血液检测 大鼠血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和总胆红素（TBIL）水平由全自动生物化学分析仪（AU5421，BD公司）检测，大鼠的外周血中性粒细胞数量及比率由血液分析仪（XE－5000，美国Sysmex公司）检测，血氨（BA）由干式生化分析仪（VITROS 5.1FS，美国强生公司）检测。

1.3.2 髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）免疫组化及Tunel染色 肝脏组织常规石蜡包埋，连续切片，常规脱蜡、复水，分别按MPO免疫组化试剂盒及Tunel检测试剂盒的操作步骤进行染色。封片后于显微镜下观察MPO着色细胞及凋亡细胞数量的变化。

1.3.3 炎性因子及趋化因子的实时荧光定量PCR检测 肝脏组织总RNA提取使用Bio Teke离心柱型高纯度快速提取试剂盒，逆转录过程使用Prime－ScriptTM RT Master Mix试剂盒，TNF－α、IL－1β的mRNA表达水平检测以β－actin作为管家基因，使用SYBR?Premix Ex TaqTM试剂盒及StepOne－PlusTM实时荧光定量PCR仪，所需引物均参考相应文献，由南京金斯瑞公司合成。TNF－α：上游引物5′－GCTCCCTCTCATCAGTTCCA－3′，下游引物5′－GGCTTGTCACTCGAGTTTTGA－3′；IL－1β：上游引物5′－CAGGAAGGCAGTGTCACTCA－3′，下游引物5′－AGACAGCACGAGGCATTTTT－3′；β－actin：上游引物5′－CTGTCCCTGTATGCCTCTG－3′，下游引物5′－ATGTCACGCACGATTTCC－3′。

1.4 统计学方法 使用SPSS19.0统计学软件进行数据处理。实验结果采用均数±标准差（珔x±s）表示。对造模后不同时间点的比较采用重复测量的方差分析，对造模后24h不同干预组的组间比较，采用单因素方差分析。P＜0.05为两组具有统计学意义。

2 结果

2.1 D－GalN诱导的急性肝衰竭SD大鼠肝功能及肝脏组织炎性因子TNF－α、IL－1β水平的变化 本研究检测了D－GalN诱导的急性肝衰竭SD大鼠造模前（0h）及造模后6、12、24、72、120、168h共计7个时间点肝功能及炎性因子TNF－α、IL－1β水平变化。结果显示，反映肝功能的生化指标的ALT、AST、TBIL及BA在造模后6h即显著升高（P＜0.05），ALT、AST 于24h达到峰值，造模后168h可恢复至造模前水平（P＞0.05）；而TBIL及BA 72h达到峰值（表1）。肝脏组织中炎性因子TNF－α、IL－1β的mRNA表达水平在造模后6h即达到峰值（P＜0.001），随后逐渐下降，至造模后72h起表达与造模前相比无统计学差异（P＞0.05，图1）。

表1 急性肝衰竭大鼠造模后血清ALT、AST、TBIL及BA的变化Tab.1 Changes of serum ALT，AST，TBIL and blood ammonia in ALF rats （珔x±s）

图1 急性肝衰竭大鼠造模后肝脏TNF－α及IL－1β表达水平的变化Fig.1Changes of TNF－αand IL－1βin the liver of ALF rats（珔x±s）

2.2 D－GalN诱导的急性肝衰竭SD大鼠外周血及肝脏中性粒细胞的变化 在D－GalN诱导的急性肝衰竭SD大鼠造模前（0h）及造模后12、24、72h共4个时间点通过血液分析仪检测外周血中性粒细胞数量及比率。结果显示，造模后12h外周血中性粒细胞数量及比率均显著上升（P＜0.001）；24h有所下降，但仍明显高于造模前水平（P＜0.001）；至72h两者与造模前相比无统计学差异（P＞0.05，表2）。免疫组化结果提示，肝脏MPO阳性中性粒细胞数量于造模后12h显著增多，造模后72h出现下降，但较造模前仍明显升高（图2）。

表2 急性肝衰竭大鼠造模后外周血中性粒细胞数量及比率的变化Tab.2 Changes of the number and percentage of peripheral blood neutrophils in ALF rats （珔x±s）

2.3 外源性给予抗中性粒细胞血清对急性肝衰竭大鼠外周血与肝脏中性粒细胞、肝功能及肝脏组织炎性因子TNF－α、IL－1β的影响 在尾静脉给予抗中性粒细胞血清后24h建立了D－GalN诱导的SD大鼠急性肝衰竭模型，并检测了造模后24h大鼠外周血与肝脏中性粒细胞、肝功能及TNF－α、IL－1β的改变。结果发现，抗中性粒细胞血清预治疗组外周血中性粒细胞数量较肝衰组显著降低（P＜0.001，图3），肝脏组织中性粒细胞数量较肝衰组也明显减少（图4）；血清ALT、AST、TBIL及BA较肝衰组出现明显回落（P＜0.05，表3）；与肝衰组相比较，中性粒细胞耗竭后Tunel阳性凋亡肝细胞数量明显减少（图5）；同时，肝脏组织炎性因子TNF－α、IL－1β的mRNA表达水平也在治疗后明显下降（P＜0.05，图6）。

图2 急性肝衰竭大鼠造模后肝脏中性粒细胞数量的变化Fig.2Changes of the number of neutrophils in the liver of ALF rats

3 讨论

图4 抗中性粒细胞血清治疗对急性肝衰竭大鼠肝脏中性粒细胞数量的影响Fig.4The effect of anti－PMN serum treatment on the number of neutrophils in the liver of ALF rats棕染细胞为中性粒细胞；A：对照组；B：肝衰组；C：治疗组。

急性肝功能衰竭在临床普遍表现为迅速出现的肝细胞功能障碍，伴全身不可控的炎性反应。通过建立D－GalN诱导的SD大鼠急性肝功能衰竭模型我们发现，肝衰大鼠肝功能生化指标ALT、AST、TBIL及BA均在短时间内显著增高，同时炎性因子TNF－α 与IL－1β在肝脏的表达于造模后6h达到峰值，并长时间维持在较高水平。我们的结果与急性肝功能衰竭的临床症状高度相符，也提示了免疫微环境在急性肝衰竭进展中的作用。TNF－α、IL－1β、IL－6等炎性因子在免疫调节中参与了中性粒细胞的招募与凋亡［7］，进入炎性组织的中性粒细胞可在高浓度促炎因子的快速诱导下释放大量活性氧、蛋白酶和生长因子，从而破坏靶组织的完整性，这种类似正反馈的作用形式在许多炎症性疾病中得到证实［8］；另一方面，MPO的变化代表着中性粒细胞的功能及活性状态。MPO可在吞噬细胞内杀灭微生物，还可释放到胞外直接破坏靶物质，对机体免疫调节发挥重要作用［9］。临床调查进一步提示，急性肝衰竭患者外周血中性粒细胞的吞噬功能显著下降，其程度与患者预后呈明显相关性［6］。动物实验也发现，急性肝衰竭状态下坏死肝细胞的DNA和线粒体产物可招募中性粒细胞，并促进中性粒细胞的肝内堆积［10］。我们的结果也显示，建立D－GalN诱导的大鼠急性肝衰竭模型后12h，外周血中性粒细胞数量及比率均显著增加，并至少持续至造模后24h；同时，急性肝衰竭大鼠肝脏内MPO阳性中性粒细胞数量在造模后早期即显著增多，表明中性粒细胞呈现高活化状态。

表3 抗中性粒细胞血清对急性肝衰竭大鼠血清ALT、AST、TBIL及BA水平的影响Tab.3 The effect of anti－PMN serum on serum ALT，AST，TBIL and blood ammonia in ALF rats（珔x±s）

图5 抗中性粒细胞血清治疗对急性肝衰竭大鼠肝细胞凋亡的影响Fig.5The effect of anti－PMN serum treatment on hepatocyte apoptosis in ALF rats

图6 抗中性粒细胞血清治疗对急性肝衰竭大鼠肝脏TNF－α及IL－1β含量的影响Fig.6The effect of anti－PMN serum treatment on TNF－αand IL－1βin the liver of ALF rats（珔x±s）

中性粒细胞的活化及其在肝脏组织中的聚积可加重肝组织损伤。研究发现，使用中性粒细胞表面受体抑制剂可显著减轻中性粒细胞相关的免疫损伤，有助于肝脏组织修复［11］。因此，通过抑制中性粒细胞在肝内的异常聚积和活化可能成为治疗急性肝衰竭的关键环节。本研究采用尾静脉外源性给予抗中性粒细胞血清来耗竭中性粒细胞，并观察其在急性肝衰竭中的作用。我们的结果显示，造模前24h注射抗中性粒细胞血清可显著减少D－GalN诱导的急性肝衰竭大鼠外周血及肝脏中性粒细胞数量，提示该干预手段可有效逆转急性肝衰状态下肝脏中性粒细胞的聚集及活化。随后我们观察了中性粒细胞耗竭对急性肝衰竭大鼠的影响，发现抗中性粒细胞血清治疗组在造模后24h可明显降低包括ALT、AST、TBIL及BA在内的肝脏生化指标，显著减轻急性肝衰竭大鼠肝细胞的凋亡比率，同时下调炎性因子TNF－α与IL－1β在肝脏的mRNA表达，有效改善了肝脏的免疫微环境。

综上所述，在D－GalN诱导的SD大鼠急性肝功能衰竭中外周血及肝脏中性粒细胞明显增多，通过耗竭外周血中性粒细胞可降低细胞凋亡及炎性因子表达。提示中性粒细胞浸润可能是加重肝损伤的关键因素，以中性粒细胞为靶点的干预手段可改善肝脏免疫微环境，为急性肝功能衰竭的治疗提供新的思路。

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（编辑 卓选鹏）（编辑 邱 芬）

Effect of anti－PMN serum treatment on D－GalN－induced ALF rats

ZHAO Xin，SHI Xiao－lei，MA Hu－cheng，DING Yi－tao
（Department of Hepatobiliary Surgery，the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School，Nanjing 210008，China）

at 6 h after modeling（P＜0.001），and it was still notably higher at 24 h than before modeling（P＜0.001）.The number and percentage of peripheral blood neutrophils and the number of neutrophils in the liver were all markedly increased 12 h after modeling（P＜0.001），and the increase continued at least until 24 h（P＜0.001）.24 h after intravenous injection of anti－PMN serum via tail vein，ALF rats had a distinct decrease in the number of peripheral blood neutrophils and neutrophils in the liver 24 h after modeling（P＜0.001）.Meanwhile，serum ALT，AST，TBIL and blood ammonia were all greatly decreased compared with those in ALF group（P＜0.05）；a significant reduction of hepatocyte apoptosis was observed.Also，the expressions of TNF－αand IL－1βin the liver were remarkably decreased after treatment（P＜0.05）.Conclusion Neutrophils accumulated in peripheral blood and liver of rats with D－GalN－induced ALF.The treatment of anti－PMN serum may have a therapeutic effect on liver function and immune microenvironment in ALF rats.

D－galactosamine（D－GalN）；acute liver failure；neutrophil；immune microenvironment

R575.3

A

10.7652/jdyxb201602015

2015－05－18

2015－11－11

国家自然科学基金资助项目（No.81170418），江苏省自然科学基金资助项目（No.BK20131084），中科院战略先导计划（No.XDA01030602）Supported by the National Natural Science Foundation of China（No.81170418），the Natural Science Foundation of Jiangsu Province （No.BK20131084），and Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences（No.XDA01030602）

丁义涛.E－mail：yitaoding@hotmail.com

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