徐磊 张双 徐继前 谭春燕 陈海燕 贺集贤 何元军

4-苯基丁酸钠对缺氧复氧诱导心肌细胞内质网应激的影响*

徐磊1,2张双2徐继前2谭春燕2陈海燕2贺集贤1何元军1

(1.广元市中心医院心内科， 四川 广元 628000；2，川北医学院附属医院心内科， 四川 南充 637000)

目的 探讨4-苯基丁酸钠(4-phenyl butyric acid，4-PBA)对缺氧复氧诱导心肌细胞内质网应激的影响。方法 建立原代培养的心肌细胞缺氧复氧模型，随机将细胞分为对照组(Control组)、4-苯基丁酸钠预处理组(4-PBA组)、缺氧复氧组(H/R组)和4-苯基丁酸钠+缺氧复氧组(4-PBA+H/R组)，应用CCK-8试剂盒检测细胞活力，caspase-3活性试剂盒测定caspase-3活性及Tunel染色测定凋亡细胞比率，western blot检测内质网应激标志性蛋白C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)表达。结果 与对照组[(100±5.31)%]比较，缺氧复氧组细胞活力[(77.45±5.67)%]显著降低(P<0.01)；而与H/R组比较，4-PBA+H/R组[(87.64±4.62)%]细胞活力明显升高(P<0.05)；H/R组caspase活性(1.86±0.14)较对照组(0.82±0.14)显著增加(P<0.01)，4-PBA预处理组(1.09±0.11)较H/R组相比明显降低(P<0.05)；H/R组Tunel阳性细胞比率[(37.55±3.51)%]较对照组[(6.78±1.75)%]相比显著升高(P<0.01)，而4-PBA+H/R组[(20.81±2.72)%]较H/R组相比显著降低(P<0.01)；H/R组CHOP表达(1.99±0.21)较对照组(0.98±0.14)显著上调(P<0.01)，而4-PBA预处理组CHOP表达(1.36±0.18)与H/R组相比明显降低(P<0.05)。结论 缺氧复氧能够诱导心肌细胞凋亡及内质网应激，而4-PBA能够减轻内质网应激及心肌细胞缺氧复氧损伤。

4-苯基丁酸钠； 缺氧复氧； 内质网应激； 细胞凋亡

内质网应激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)是细胞应对刺激的一种适应性反应，但是过度内质网应激又可以通过激活相关的信号通路引起细胞损伤甚至细胞凋亡[1,2]。研究表明，内质网应激参与心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion ,I/R)损伤[3]，抑制内质网应激可减轻心肌I/R损伤[4]，然而内质网应激抑制剂4-苯基丁酸钠(4-PBA)能否有效减轻心肌缺氧复氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)损伤还有待进一步研究。本研究拟通过使用内质网应激抑制剂4-PBA预处理心肌细胞并观察其对H/R心肌细胞作用，探索其能否应用于心血管疾病的防治。

1 材料与方法

1.1 原代小鼠心肌细胞培养 根据以前的方法[5]，选取出生1～3天小鼠乳鼠，断头法处死后采用胰酶、胶原酶混合消化的方法提取心室肌细胞，采用差速贴壁方法分离成纤维细胞而纯化心肌细胞，纯化细胞经培养48～72小时后用于实验。

1.2 分组及缺氧复氧模型建立 原代培养小鼠心肌细胞分为4组：对照组(Control组)、4-苯基丁酸钠预处理组(4-PBA组，在实验前使用含有4-PBA的培养基在正常条件下培养4小时，然后换用正常培养基)、缺氧复氧组(H/R组，通过将正常培养基更换为不含血清及葡萄糖的培养基，并用含5%CO2的N2充分饱和30min达到缺氧目的，然后在含5%CO2的N2填充小室中培养4小时模拟缺氧培养，其后换用正常培养基在正常培养箱中培养4小时模拟复氧[6])和4-苯基丁酸钠+缺氧复氧组(4-PBA+H/R组，即在实验前用含4-PBA培养基预处理4小时，然后进行缺氧复氧处理)。

1.3 心肌细胞凋亡水平及细胞活力测定 根据先前方法[6,7]，心肌细胞晚期凋亡水平通过Tunel染色法按照罗氏公司提供的染色操作流程染色，使用荧光显微镜镜下观察拍片并计算Tunel阳性核细胞比率评估；另外，按照caspase-3试剂盒操作说明，测定各组提取蛋白中caspase-3活性来评估心肌细胞早期凋亡水平；按照日本同仁公司CCK-8试剂盒操作流程检测各组心肌细胞活力。

1.4 内质网应激CHOP蛋白检测 缺氧复氧处理后，提取各组细胞蛋白，通过western blot检测心肌细胞内质网应激相关凋亡标志性蛋白CHOP蛋白表达水平。

1.5 统计学分析 数据以均数±标准误表示，采用 Graph-Pad Prism 5. 0软件统计分析并作图， 两组间差异比较用 Newman Keuls分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4-PBA对缺氧复氧引起心肌细胞活力下降的影响 各组心肌细胞活力测定结果见图1，与control组相比，4-PBA组细胞活力并没有明显差异(P>0.05)，而H/R组细胞活力明显下降(P<0.01)；与H/R组相比，4-PBA预处理组细胞活力有显著增加(P<0.05)。

图1 缺氧氧复对心肌细胞活力影响

Fig 1 Effect of H/R on cardiomyocytes viability

注：与对照组比较，①P<0.05；与H/R组比较，②P<0.05

2.2 4-PBA对缺氧复氧引起的心肌细胞凋亡的影响 为评估心肌细胞凋亡水平，我们通过capase-3活性测定早期凋亡及Tunel染色方法测定晚期心肌细胞。结果显示，与control组相比，H/R组心肌细胞capase-3活性和Tunel阳性核细胞比例显著增加(均P<0.01)；与H/R组相比，4-PBA+H/R组caspase-3活性和Tunel阳性核细胞比率均明显降低(均P<0.05)，见图2。H/R组与control组心肌细胞凋亡率相比有显著增加(P<0.01)，4-PBA+H/R组与H/R组相比有明显减少(P<0.01)，见图3。

2.3 4-PBA减轻缺氧复氧诱导的内质网应激 为明确4-PBA对心肌细胞缺氧复氧诱导的内质网应激的影响，我们检测各组CHOP蛋白表达水平。结果发现，与control组相比，H/R组CHOP表达水平明显升高(P<0.01)；与H/R组相比，4-PBA+H/R组CHOP表达有明显下降(P<0.05)，见图4。

图2 各组测定caspase-3活性结果

Fig 2 Caspase-3 activity in different groups

注：与control组相比，①P<0.05；与H/R组相比，②P<0.05

图4 各组CHOP蛋白表达

Fig 4 The expression of CHOP in different groups

注：与control组相比，①P<0.01;与H/R组相比，②P<0.05

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤中，心肌细胞超微结构、细胞功能以及基本生物学活性都会发生改变，其分子机制目前包括胞质内钙超载、氧化应激、线粒体通透性转换孔开放、胞质促凋亡因子释放等等[6,8]。ERS是细胞应对各种刺激的一种适应性反应，然而这种反应对于细胞本身却是一把“双刃剑”，在轻度的损伤性刺激下细胞可通过促进未折叠蛋白折叠为成熟蛋白以及相关细胞转录因子作用减轻细胞内质网稳态的失衡，从而减轻细胞损伤[9]；但是另一方面，过度的长时间的ERS却可以通过激活内质网特征性的JNK、CHOP、caspase-12信号通路引起细胞凋亡损伤[10,11]。越来越多的研究表明，ERS的促凋亡作用参与许多病理生理状态，其在心肌I/R损伤、心肌梗塞、心力衰竭、高血压等疾病的发病中具有重要作用，而抑制ERS能够显著减轻心肌细胞损伤，改善心脏功能[12～14]。

4-PBA是一种小分子化合物，目前主要是作为ERS抑制剂被用于研究癌症、糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森症及神经系统退行性病变等与ERS相关的疾病。研究表明，4-PBA能够通过减轻ERS，改善糖尿病小鼠的肝脏、骨骼肌、脂肪组织的血糖浓度，正因为4-PBA有极大可能成为糖尿病治疗的药物所以受到广泛关注和研究[15,16]。Ayala P等[17]在异丙肾上腺素构建的小鼠心室重构模型中发现，4-PBA预处理能够减轻ERS而减少心肌细胞损伤、延缓心肌纤维化的进展和对抗心室重构。而Luo T等[18]在另外一项研究中发现，4-PBA灌胃处理能够减轻主动脉缩窄大鼠的心室重量以及心肌间质中的胶原沉积，这与其选择性减轻肥厚心肌ERS具有重要关系，4-PBA从理论上可以作为对抗压力依赖性心室重构的药物研究。

目前对于4-PBA是否能够通过减轻ERS而减轻心肌细胞I/R损伤尚未见报道。因此，我们拟通过4-PBA预处理原代培养心肌细胞构建缺氧复氧损伤模型来模拟I/R损伤，观察其对H/R诱导心肌细胞内质网应激的影响，以验证其应用心血管疾病研究的可能性。结果发现，心肌细胞H/R后心肌细胞活力明显下降，心肌细胞凋亡水平显著升高，ERS相关的促凋亡蛋白CHOP表达显著增加，4-PBA预处理则能够明显减轻这种效应。另外，这说明了ERS相关的细胞凋亡途径明确参与的心肌细胞H/R损伤，4-PBA能够通过抑制ERS来减轻H/R引起的心肌细胞损伤，并且是通过抑制ERS相关的CHOP促凋亡信号通路实现的。

4 结论

H/R能够引起原代培养心肌细胞ERS，并激活ERS相关的CHOP促凋亡信号通路导致心肌细胞凋亡；4-PBA能通过减轻ERS及降低ERS相关的促凋亡蛋白CHOP表达减少心肌细胞凋亡；4-PBA是一种有用的抗心肌细胞H/R损伤药物，但其是否能够作为临床药物应用于心肌I/R损伤的防治还有待更进一步研究。

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Effect of 4-PBA on hypoxia/reoxygenation induced endoplasmic reticulum stress in cardiomycytes

XU Lei1,2，ZHANG Shuang2,XU Jiqian2,etal

(1.DepartmentofCardiology,CentralHospitalofGuangyuan,Guangyuan628000,Sichuan,China;2.DepartmentofCardiology,TheAffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan,China)

Objective This study was designed to explore the effect of 4-PBA on hypoxia/reoxygenation induced endoplasmic reticulum stress (ERS) in cardiomyocytes H/R injury. Methods Primary cultured cardiomyocyctes were exposure to H/R to stimulating I/R injury and randomly divided to control group (Control), 4-PBA group (4-PBA), H/R group, 4-PBA +H/R group (4-PBA +H/R). CCK-8 assessed the cell viability of cardiomyocyctes, Caspase-3 activity was measured and Tunel staining was performed to estimate the apoptotic cardiomyocytes. Western blot was used to assess the protein expression of CHOP. Results Compared to the control group [(100±5.31)%[], cell viability in H/R group[(77.45±5.67)%] was significantly decreased (P<0.01). 4-PBA pretreatment [(87.64±4.62)%] ameliorated, compared to the H/R group(P<0.05). Caspase-3 activity in H/R group(1.86±0.14) was obviously increased compared to that in the control group(0.82±0.14)(P<0.01). 4-PBA pretreatment decreased viability, compared to the H/R group(P<0.05). Apoptotic index in H/R group[(37.55±3.51)%] was increased compared to that in the control group [(6.78±1.75)% ](P<0.01). 4-PBA pretreatment[(20.81±2.72)%] decreased the apoptotic index, compared to the H/R group(P<0.01). Expression of CHOP in H/R group(1.99±0.21) was upregulated compared to the control group(0.98±0.14)(P<0.01) and the upregulating of CHOP in H/R group was attenuated as compared to the 4-PBA+H/R group(1.36±0.18)(P<0.05). Conclusion H/R exposure treatment could induce cardiomyocytes apoptosis and ERS, and 4-PBA pretreatment could effectively protect cardimyocytes against H/R injury via attenuating ERS and apoptotic cell death.

4-phenyl butyric acid； Hypoxia/reoxygenation； Endoplasmic reticulum stress; Aopoptosis

国家自然科学基金(81070101)；四川省教育厅课题(15ZB0200)

R-33

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.03.010

2015-12-01； 修回日期： 2016-01-17； 编辑： 母存培)