王艺华，宋吉利（国家葡萄酒及白酒、露酒产品质量监督检验中心，山东烟台264003）



葡萄酒中白藜芦醇含量不确定度的评定

王艺华，宋吉利
（国家葡萄酒及白酒、露酒产品质量监督检验中心，山东烟台264003）

摘要：根据JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》和CNAS—GL06《化学分析中不确定度的评估指南》的原理与方法，建立了液相色谱测定葡萄酒中白藜芦醇含量的数学模型。对测量结果的不确定度来源进行分析，分别对A类不确定度和B类不确定度进行评定。计算了各不确定度分量、合成标准不确定度和扩展不确定度。结果表明，不确定度主要来源于测量重复性，其次为量器校准、标准物质纯度和进样针。

关键词：不确定度；白藜芦醇；液相色谱；葡萄酒

近几年来，不确定度的概念在检测分析领域日益受到重视[1-2]。1999年12月15日，国际标准化组织（ISO）和国际电工委员会（IEC）在共同发布的ISO/IEC 17025：2005标准[3]中明确规定，无论是校准实验室还是测试实验室，都必须建立并实施测量不确定度的评估程序，以确保测试结果的准确性和可靠性。这是测试实验室通过ISO/IEC 17025：2005标准的一道新课题。

白藜芦醇学名为1,2-二苯乙烯,它的产生与葡萄植株受真菌的感染或非生物刺激(如紫外辐射)有关。其多以其单体及糖苷（piceid，3，4'，5-三羟基二苯乙烯-3-β-D-葡萄糖苷）形式存在，故一般有4种存在形式：顺式、反式白藜芦醇和顺式、反式白藜芦醇糖苷。白藜芦醇存在于葡萄中也存在于葡萄酒中，在大多数葡萄酒中反式结构占主导地位[4-9]。

白藜芦醇的检测方法主要有气相法和液相法，目前多采用GB/T15038—2006[10]标准规定的方法。该方法是以高效液相色谱（HPLC）法测定其含量，但因该方法涉及提取、净化、浓缩等步骤，添加回收率较低，对测定结果有较大影响，故对该方法进行部分改进，减少样品处理步骤，提高测定结果的准确度。

本实验根据国家计量技术规范JJF 1059.1—2012[11]标准的要求，对利用HPLC法测定葡萄酒中白藜芦醇含量的不确定度进行了分析和评定，并给出了标准的表示方法。

1　材料与方法

1.1材料、仪器和试剂

样品：烟台西夫拉姆有限公司生产的迪拉丽·高含量白藜芦醇干红葡萄酒。

仪器：Waters 2695高效液相色谱仪（配有紫外检测器）、BS210S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

试剂：反式白藜芦醇标准品（Stanford Chemicals生产）、乙醇（分析纯）、甲醇（分析纯），实验用水为超纯水。除另有规定外，试剂均为分析纯。

1.2测定方法

1.2.1标准溶液的测定

a.称取标准品反式白藜芦醇0.2000 g，用乙醇（分析纯）溶解并定容至100 mL，配制成2 g/L的标准溶液。

b.吸取2 g/L的标准溶液2.00 mL，将乙醇定容至100 mL，配制成40 mg/L的标准使用液。

1.2.2样品的测定

样品的测定过程包括取样、制样和测定3个步骤。参照GB/T 15038—2006[10]中的检测方法，优化检测步骤为：移取葡萄酒样品10.00 mL于100.00 mL容量瓶中，蒸馏水定容。稀释液过0.45 μm滤膜，滤液即进HPLC分析。

1.3数学模型

根据1.2的测定方法，建立葡萄酒中白藜芦醇含量测定的数学模型，如（1）式所示：

式中：X——试样中白藜芦醇的含量，mg/L；

C——由标准曲线得出的样品溶液中白藜芦醇的含量，mg/L；

V2——吸取葡萄酒样品的体积，mL；

V1——样品稀释液总体积，mL；

Frec——添加回收率，%；

Frep——重复性校正因子。

由于葡萄酒系体态均匀的液体样品，从而制得有代表性的样品，故取样代表性产生的不确定度可以忽略不计，则（1）式即为白藜芦醇含量测定的不确定度数学模型。

从数学模型可以看出，各影响参数相互独立，且各参数的不确定度直接对被测量X的不确定度产生影响，即灵敏系数等于1，合成标准不确定度可以用相对标准不确定度进行合成，根据JJF 1059.1—2012[11]中6.7，合成标准不确定度uCrel表示为：

由公式（1）和公式（2）可推导出测试样品的相对合成标准不确定度计算公式：

2　不确定度的来源分析

计算不同的不确定度分量时，应利用在实验室内验证试验研究的测定数据。本测定方法不确定度从总体上考虑，分为以下3种：（1）测量重复性引入的不确定度分量ur（Frep）；（2）总偏差（回收）引入的不确定度分量ur（Frec）；（3）不能全面考虑的其他影响因素有关的不确定度，主要是样品测试全过程引入的其他不确定度分量ur。

2.1测量重复性引入的不确定度分量ur（Frep）

对不同样品进行一系列平行测试（同一均匀样品、完整的提取/测定程序），以获得该分析程序的总的随机变化（精密度）。

2.2偏差引入的不确定度分量ur（Frec）

分析程序的偏差是通过在实验室内部确认研究中使用加料样品进行的研究。

2.3样品测试全过程引入的不确定度分量ur

2.3.1标准溶液测定过程引入的不确定度ur（C）

主要包括：标准物质纯度引入的不确定度；称量产生的不确定度；标准溶液配制过程量器产生的不确定度；10 μL进样针准确度引入的不确定度；HPLC仪器准确度引入的不确定度分量。

2.3.2样品测定过程引入的不确定度ur（V）

主要包括：样品制备过程量器产生的不确定度；10 μL进样针准确度引入的不确定度；HPLC仪器准确度引入的不确定度分量。

3　测量不确定度分量的分析和评定

根据标准不确定度的来源分别进行不确定度的评定。

3.1测量重复性引入的不确定度分量ur（Frep）

测量重复性引入的不确定度分量ur（Frep），样品反复进行10次分析，见表1。

表1 测量重复性引入的不确定度

ur（Frep）=s1/ x=1.03×10-2。（A类不确定度）

3.2总偏差引入的不确定度分量ur（Frec）

5个样品的添加回收率分别为82 %、85 %、90 %、91 %、80 %，平均回收率为85.6 %，标准偏差s为4.8 %。

标准不确定度采用平均值的标准偏差：

ur（Frec）=0.048/309.9=1.55×10-4。（A类不确定度）3.3样品测试全过程引入的不确定度分量ur（B类不确定度）

3.3.1标准溶液引入的不确定度ur（C）

3.3.1.1标准物质纯度引入的不确定度ur1

3.3.1.2称量产生的不确定度ur2

以减量法称取标准物质的质量0.2015 g。称量使用万分之一数字电子天平，计量证书标明其线性为±0.15 mg，采用矩形分布，k=，天平的线性分量为：

减量法称量过程天平使用2次，故称量白藜芦醇产生的标准不确定度为：

相对标准不确定度为：

3.3.1.3标准溶液配制过程量器产生的不确定度ur3

标准溶液配制过程中所用量器为：2个100 mL单标线容量瓶、1个2 mL单标线移液管。按照《化学分析中不确定度的评估指南》[13]，100 mL容量瓶的体积有3个主要影响因素：校准、重复性和温度。

（1）校准：证书给出的容量瓶在20℃下的体积为100 mL±0.1 mL，计算标准不确定度时假设为三角形分布：

（2）重复性：由于充满容量瓶的变化引起的不确定度可通过该容量瓶的典型样品的重复性实验来评估。对典型的100 mL容量瓶充满10次并称量的实验，得出标准偏差为0.02 mL，可直接用作标准不确定度。

（3）温度：根据证书提供的信息，该容量瓶已在20℃校准，而实验室的温度在±3℃之间变动。该影响引起的不确定度可通过估算该温度范围和体积膨胀系数来进行计算。液体的体积膨胀明显大于容量瓶的体积膨胀，因此只需考虑前者即可。乙醇的体积膨胀系数为0.75× 10-3/℃，因此产生的体积变化为：

±（100×3×0.75×10-3）=±0.225 mL。

计算标准不确定度时假设温度变化是矩形分布，即：

3种分量合成得到体积的标准不确定度：

其相对标准不确定度为：

对于2 mL单标线移液管，只考虑由校准引入的不确定度。证书给出的移液管在20℃下的体积为2 mL± 0.008 mL，按照矩形分布考虑，k=，标准不确定度为：

3.3.1.4 10 μL进样针准确度引入的不确定度ur4

3.3.1.5 HPLC仪器的准确度引入的不确定度ur5

5种分量合成得到标准溶液产生的不确定度ur(C)：

3.3.2样品产生的不确定度ur(V)

3.3.2.1样品制备过程量器产生的不确定度ur6

样品制备过程中所用量器为：100 mL单标线容量瓶、10 mL单标线移液管。

100 mL容量瓶体积的3个影响因素产生的不确定度：

（2）重复性：0.02 mL；

（3）温度：水的体积膨胀系数为2.1×10-4/℃，因此产生的体积变化为：

±（100×3×2.1×10-4）=±0.063 mL。

计算标准不确定度时假设温度变化是矩形分布，即：

3种分量合成得到体积的标准不确定度：

其相对标准不确定度为：

对于10 mL单标线移液管，只考虑由校准引入的不确定度。证书给出的移液管在20℃下的体积为10 mL± 0.010 mL，按照矩形分布考虑，k=，标准不确定度为：

其相对标准不确定度为：

3.3.2.2 10 μL进样针准确度引入的不确定度u7

表2 标准不确定度一览表

证书给出的公差为±0.02 μL，按照矩形分布考虑，k=，标准不确定度为：

3.3.2.3 HPLC仪器的准确度引入的不确定度u8

由证书可知，σ＝0.0018 mg/kg，按照矩形分布考虑，k=，标准不确定度为：

3种分量合成得到标准溶液产生的不确定度ur(V)：

3.3.3合成标准不确定度计算（表2）

合成相对不确定度：

3.3.4扩展不确定度通过使用包含因子k=2计算得出：

U95=1.09×10-2×2×309.9=6.76≈6.8 mg/L。

3.3.5不确定度报告

本次检测葡萄酒中白藜芦醇含量为：309.9 mg/L，U= 6.8 mg/L；k=2。

4　小结

本文评定了液相色谱法测定葡萄酒中白藜芦醇含量的不确定度，通过评定可以初步得出如下结论：在评估白藜芦醇测定方法的不确定度过程中，测量重复性、标准溶液测定和样品测定对不确定度的贡献较大，其中测量重复性贡献最大。深入分析可知，标准溶液测定过程中主要的不确定度来源为：量器校准、标准物质纯度和进样针准确度；样品测定过程中主要的不确定度来源为：进样针准确度。

因而在评定葡萄酒中白藜芦醇含量不确定度过程中，应主要考虑测量重复性引入的不确定度的影响，其次考虑量器校准、标准物质纯度和进样针等所引入的不确定度的影响。

参考文献：

[1]魏志华,付洁.丁二酮肟重量法测定镍量的不确定度评定[J].现代计量测试,2000(1)：53-58.

[2]魏莉萍,林景雪,马月琴,等.差示扫描量热法测量纯度的不确定度分析[J].化学分析计量,2001(4)：4-7.

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[11]全国法制计量管理计量技术委员会.测量不确定度评定与表示：JJF 1059.1—2012 [S].北京：中国标准出版社,2013.

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[13]中国合格评定国家认可委员会.化学分析中不确定度的评估指南：CNAS—GL06[S].北京：中国合格评定国家认可委员会,2006.

Evaluation of the Uncertainties in the Determination of Resveratrol Content in Grape Wine

WANG Yihua and SONG Jili
(China National Wine Quality Supervision and Inspection Center, Yantai, Shandong 264003, China)

Abstract:Based on JJF 1059.1-2012 and CNAS-GL06, the mathematical model had been developed for the determination of resveratrol content in grape wine by HPLC. The source of the uncertainties in the measurement was analyzed, and Type A and Type B uncertainties were assessed respectively. Each uncertainty component, combined standard uncertainty and expanded uncertainty were calculated. The results showed that the uncertainty mainly came from gauge repeatability, calibration of volumetric apparatus, standard material purity and injection needle.

Key words:uncertainty; resveratrol; high performance liquid chromatography (HPLC); grape wine

作者简介：王艺华(1981-),女,硕士,工程师,主要从事葡萄酒检测工作。

收稿日期：2015-12-17

DOI：10.13746/j.njkj.2015470

中图分类号：TS262.6；TS261.7

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）04-0102-04

优先数字出版时间：2016-02-25；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160225.1734.005.html。