闵婷+郑梦林+李阳+殷学仁+陈昆松+易阳+王宏勋

摘要： 涩柿果实采收后须经人工脱涩才能用于鲜食，其中高体积分数CO2脱涩处理应用最广泛。经高体积分数CO2处理后，柿果实在贮藏过程中也会发生褐变。多酚氧化酶PPO作为酶促褐变最关键的基因，在各种果蔬中的研究较多，而关于PPO基因是否参与涩柿果实脱涩后褐变的研究尚未见报道。以“恭城水柿”为材料，经95% CO2处理2 d后切片，通过可溶性单宁含量测定、褐变程度观察、PPO基因克隆与表达分析研究CO2处理对“恭城水柿”褐变的影响。结果表明，经95% CO2处理后，柿果实的可溶性单宁含量明显下降，柿果实完成脱涩。脱涩后的柿鲜切片于20 ℃下放置12 h后发生明显褐变。本研究克隆获得PPO基因部分片段序列，聚类分析表明，该PPO基因与苹果PPO基因较同源；基因表达分析显示，该PPO基因在CO2处理后的鲜切柿片中的表达量比对照低，表明该PPO基因可能与柿子脱涩后的褐变无相关性。

关键词： 恭城水柿；脱涩；褐变；PPO

中图分类号： TS255.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）03-0288-03

柿（Diospyros kaki）属于柿科（Ebenaceae）柿属（Diospyros），起源于东亚，主要分布于中国、日本、韩国等东亚国家[1]。不同于其他水果，柿果实的独特之处在于其能累积大量单宁，其中可溶性单宁可导致涩味。柿果实根据其自然脱涩的能力分为甜柿和涩柿。甜柿能在树上自然完成脱涩，采收后可直接食用；涩柿果实成熟时可溶性单宁含量仍较高，采收后须经人工脱涩方能鲜食[2]。我国栽培的品种多为涩柿，涩柿的脱涩技术较为成熟，包括乙烯处理、CO2处理[3]、温水浸泡、交替冻融[4]等，其中高体积分数CO2处理应用最为广泛。然而，高体积分数CO2处理柿果实后，果实在贮藏过程中也会发生褐变，且处理时间越长则褐变程度越深[5]，使柿果实在贮藏和货架期的果实品质下降。

褐变是果实品质劣变最明显的特征之一，不仅影响果品的营养、外观、风味，并已成为果蔬贮藏加工的主要障碍[6]。果蔬褐变多以酶促褐变为主，与酶促褐变密切相关的酶类主要为多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO），多酚类物质在PPO的作用下氧化成醌，醌再聚合生成黑色或褐色的色素沉淀，组织表现为褐变。随着分子生物学的发展，马铃薯[7]、梨[8]、甘薯[9]、蘑菇[10]、莲藕[11]等植物的PPO基因相继被克隆，而关于柿果实中PPO酶活性及其特性的报道较少。

以“恭城水柿”为材料，经95% CO2处理2 d后切片，通过可溶性单宁含量分析、褐变程度观察、PPO基因克隆与表达分析研究CO2处理对“恭城水柿”褐变的影响，并进行PPO基因的克隆、进化树分析、基因表达分析，以期阐明柿果实脱涩后褐变的生物学机制。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

供试“恭城水柿”购自广西壮族自治区恭城县商业果园。甲醇、没食子酸、福林酚、NaCO3、NaCl、HCl、十六烷基三甲基溴化铵、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、聚乙烯吡咯烷酮、LiCl、十二烷基硫酸钠、氯仿、异戊醇、无水乙醇均购自国药集团化学试剂有限公司。DEPC水、亚精胺、巯基乙醇均购自上海生工试剂公司。液氮购自湖北省武汉市明辉气体有限公司。双蒸水。

1.2 主要仪器

V-110D型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司），HH-S4型数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂），GL-20G-2型飞鸽牌离心机（上海安亭科学仪器厂），00101D型立式压力蒸汽灭菌锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），S2-93型自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂），DHG-9140A型电热鼓风干燥器（上海一恒科学仪器有限公司），HYC-326A型医用冷藏箱（青岛海尔特种电器有限公司），DYCP-31DN型电泳仪（北京市六一仪器厂），CP214（C）型电子天平（上海奥豪斯仪器有限公司），PTT-A500型电子天平（福州华志科学仪器有限公司），IMS-20型雪科制冰机（常熟市雪科电器有限公司），凝胶成像仪（美国伯乐公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 脱涩处理 成熟“恭城水柿”果实自商业果园采收后，于2 d内运至实验室。选择成熟度相对一致、果形匀称、大小中等、无机械损伤的果实进行相关采后试验。将果实平均分为2组，每组约50个，一组经95% CO2处理2 d后转货架[12]；另一组作为对照，置于20 ℃下直至试验结束。

1.3.2 切片处理 将脱涩试验完成后的处理组和对照组果实去皮，并切片为3.0 cm×3.0 cm×0.3 cm大小，2组各切30片，置于20 ℃下12 h后拍照，液氮取样用于后期试验。

1.3.3 可溶性单宁含量测定 采用福林酚方法[12]进行可溶性单宁含量测定。没食子酸用于标准曲线的制作，每次测量重复3次，每个点进行3次生物学重复。可溶性单宁的质量分数用果实质量的百分含量表示。

1.3.4 PPO基因的克隆与表达 进行PPO基因的克隆[11]，根据前期RNA-seq获得PPO基因序列，利用Primer 3在线软件（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/）设计引物（表1）。按照试剂盒PCR扩增所得的目标片段连接，转化到大肠杆菌DH5α（TaKaRa公司），挑选阳性克隆并进行测序验证。

进行PPO基因表达试验[12]，包括模板合成、引物特异性检测、实时定量PCR（QPCR）分析。

2 结果与分析

2.1 95% CO2处理对柿果实可溶性单宁含量的影响

可溶性单宁是柿果实涩味的主要呈现者，可溶性单宁含量越高则涩味越严重。试验测定了对照组及95% CO2处理2 d后的柿果实可溶性单宁含量。结果表明，经95% CO2处理后，可溶性单宁含量仅为0.19%，明显低于对照组的1.40%（图1），这与已有研究的结论[12]相一致。可见，95% CO2处理能明显降低“恭城水柿”的可溶性单宁含量，实现柿果实的脱涩。

2.2 95% CO2处理对柿果实褐变的影响

将95% CO2处理后的柿果实切片为3.0 cm×3.0 cm×0.3 cm，于室温放置12 h后观察拍照（图2）。结果表明，对照果实无明显变化；经95% CO2处理后的果实切片褐变现象明显，这与已有研究的结论[5]相一致。可见，95% CO2处理能使“恭城水柿”在贮藏后期发生褐变。

2.3 柿果实PPO基因的克隆与表达

根据前期RNA-seq结果设计PPO基因克隆引物、荧光定量PCR引物（表1），并克隆获得PPO基因部分片段序列，命名为DkPPO。与马铃薯、苹果、番茄的PPO基因进行聚类分析显示，DkPPO与苹果PPO基因同源关系较近（图3）。进一步基因表达分析表明，该PPO基因在CO2处理后的鲜切柿片中的表达量比对照低（图4），表明该PPO基因可能未参与柿果实脱涩处理后的褐变。

3 结论

本研究探讨了CO2处理对“恭城水柿”褐变的影响。结果表明，柿果实经95% CO2处理后，其可溶性单宁含量明显下降，柿果实完成脱涩。脱涩后的柿鲜切片于20 ℃下放置12 h后发生明显褐变。克隆获得PPO基因部分片段序列，基因表达结果显示，DkPPO基因在CO2处理后的鲜切柿片中的表达量比对照低，表明该PPO基因可能未参与柿果实脱涩处理后的褐变。CO2处理导致“恭城水柿”褐变的原因有待进一步研究。

参考文献：

[1]Wang R Z，Yang Y，Li G C. Chinese persimmon germplasm resources[J]. Acta Horticulturae，1997，436：43-50.

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[11]张跃进，郝晓燕，梁宗锁，等. 莲藕多酚氧化酶基因（PPO）的克隆与表达分析[J]. 农业生物技术学报，2011，19（4）：634-641.

[12]Min T，Fang F，Ge H，et al. Two novel anoxia-induced ethylene response factors that interact with promoters of deastringency-related genes from persimmon[J]. PLoS One，2014（9）：e97043.